赵小强ZERO

V1

2022/07/26阅读:7主题:全栈蓝

Alkbh1

技术路线

实验内容

细胞:BMSCs脂肪分化1 μg/ml mouse optineurin (optn)-plasmid
染色:碱性磷酸酶(ALP)染色、茜素红染色、Red O 染色
qRT-PCR Western blot
斑点杂交(Dotblotting)
µCT analysis
免疫荧光:Alkbh1
组织化学和免疫组织化学
钙黄绿素双标记分析
ChIP assays:ChIP-qPCR assay

读图1:Alkbh1下调表达 in BMSCs during aging

A:来自GTEx的31个人正常组织中的Alkbh1表达模式
B:免疫荧光显示3个月大小鼠骨髓中Aklbh1(绿色)和巢蛋白(红色)的共定位。比例尺:50μm
C:免疫荧光显示培养的骨髓细胞中Aklbh1(绿色)和巢蛋白(红色)重叠。比例尺:100μm
D:微阵列数据中前500个deg的热图(GSE35955)
E和F:qRT-PCR和western blot分析年轻(3个月大)和老年(18个月大)小鼠(n=3)BMSCs中Alkbh1的表达

读图2:BMSCs中Alkbh1的缺失导致成骨分化受损和成脂分化增强

A:转基因小鼠PCR基因分型的代表性图像。
B和C:来自Prx1-Cre的BMSCs中Alkbh1表达的qRT-PCR(B)和western blot(C)分析;Alkbh1fl/fl和Alkbh1fl/fl小鼠(n=3)。
D:来自Prx1-Cre的BMSCs的ARS和ALP染色的代表性图像和量化;成骨分化下的Alkbh1fl/fl和Alkbh1fl/fl小鼠(n=3)。
E–H:qRT-PCR分析显示来自Prx1-Cre的BMSCs中Runx2、ALP、SP7和Bglap的转录减少;成骨分化下的Alkbh1fl/fl小鼠(n=3)。
I:Prx1-Cre骨髓间充质干细胞油红O染色的代表性图像和定量;Alkbh1fl/fl和Alkbh1fl/fl小鼠在脂肪分化下(n=3)。比例尺:50μm。
J和K:qRT-PCR分析显示来自Prx1-Cre的BMSCs中Pparg和Fabp4的转录增加;脂肪分化下的Alkbh1fl/fl小鼠(n=3)。

读图3:敲除BMSCs中的Alkbh1导致骨量减少和骨髓脂肪增加

A–E:3个月大和15个月大雄性小鼠(n=6–8)股骨的代表性μCT图像和定量分析。
F和G:HE染色的代表性图像(F)和股骨中脂肪细胞数量的定量(G)(n=5)。比例尺:100μm。
H和I:股骨中骨钙素阳性细胞的免疫组化染色(H)和定量分析(I)的代表性图像(n=5)。比例尺:50μm。 J和K:小梁骨钙黄绿素双标记的代表性图像(J)和MAR(K)的定量分析(n=5)。比例尺:20μm。

读图4:Alkbh1的缺失抑制optn的转录

A: 免疫荧光显示Alkbh1蛋白主要定位于小鼠骨髓间充质干细胞的细胞核内。DAPI为蓝色,Aklbh1为绿色,nestin为红色。比例尺:25μm。
B:斑点杂交分析显示,来自Prx1-Cre的BMSCs中基因组DNA 6mA水平增加;Alkbh1fl/fl小鼠。
C:与骨髓间充质干细胞分化相关的选定基因的热图(GSE30561)。
D: ChIP-seq图谱显示在optn启动子区域的Alkbh1-Flag-ChIP-seq富集。
E:标志的芯片qPCR。Alkbh1标志结合optn启动子区域(n=3)。
F:N6 mA的芯片qPCR。敲除Alkbh1可增加optn启动子区域的N6-mA富集(n=3)。
G和H:optn表达的qRT PCR(G)和western blot(H)分析(n=3)。

读图5:optn的过表达拯救了Alkbh1敲除BMSCs的异常谱系分配

A:optn和Alkbh1的Western blot分析。
B和C:ARS和ALP染色的代表性图像(B)和定量(C)(n=3)。
D–G:qRT-PCR分析成骨分化下BMSCs中Runx2、ALP、SP7和Bglap的转录(n=3)。
H:脂肪分化下骨髓间充质干细胞油红O染色的代表性图像和定量(n=3)。比例尺:50μm。
I和J:qRT-PCR分析脂肪分化下BMSCs中Pparg和Fabp4的转录(n=3)。

读图6:过表达Alkbh1可减弱老年小鼠的骨丢失和骨髓脂肪堆积

A和B:Alkbh1表达的qRT PCR(A)和western blot(B)分析(n=3)。
C–G:股骨远端的代表性μCT图像和定量分析(n=5)。
H和I:HE染色的代表性图像(H)和股骨中脂肪细胞数量的量化(I)(n=5)。比例尺:100μm。
J和K:股骨中骨钙素阳性细胞的免疫组化染色(J)和定量分析(K)的代表性图像(n=5)。比例尺:50μm。
L和M:小梁骨钙黄绿素双标记的代表性图像(L)和MAR(M)的定量分析(n=5)。

分类:

其他

标签:

医学

作者介绍

赵小强ZERO
V1