冷冻工厂

V1

2022/11/26阅读:33主题:科技蓝

RNA-seq 详细教程:实验设计(2)

学习目标

  • 了解设置重复对于 RNA-seq 分析的重要性
  • 了解生物重复次数、测序深度和鉴定到的差异表达基因之间的关系
  • 了解如何设计RNA-seq 实验,以避免批次效应

1. 注意事项

了解 RNA 提取和 RNA-seq 文库制备实验过程中的步骤,有助于设计 RNA-seq 实验,但有一些特殊的注意事项需要明确:

  1. 重复次数和类型
  2. 避免混淆
  3. 处理批次效应

2. 重复

实验重复可以通过技术重复或生物学重复来实现,如下图:

Klaus B., EMBO J (2015) 34: 2727-2730
Klaus B., EMBO J (2015) 34: 2727-2730
  • 技术重复

使用相同的生物样本重复实验步骤,以准确测量技术差异并在分析过程中将其去除。

  • 生物学重复

使用相同条件下的不同生物样本来衡量样本间的差异。


在微阵列时代,技术重复被认为是必要的;然而,当前的 RNA-seq 技术,技术差异远低于生物差异,因此不需要技术重复。相反,生物重复对于差异表达分析是绝对必要的。

对于差异表达分析,生物学重复越多,对生物学变异的估计就越好,我们对平均表达水平的估计也就越精确。因此,数据可以进行更准确的建模并识别更多差异表达的基因。

Liu, Y., et al., Bioinformatics (2014) 30(3): 301–304
Liu, Y., et al., Bioinformatics (2014) 30(3): 301–304

如上图所示,生物重复比测序深度更重要,测序深度是每个样本测序的读数总数。该图显示了测序深度和重复次数对鉴定出的差异表达基因数的关系。与增加测序深度相比,重复次数的增加往往会得到更多的差异表达基因。因此,通常更多的重复比更高的测序深度更好,但需要注意的是,检测低表达的差异表达基因和执行异构体水平(可变剪切)的差异表达分析需要更高的深度。

下面列出了一些关于重复和测序深度的建议,用于实验规划:

  • 通用建议:

    • ENCODE 建议每个样本有 3000 万个 SE reads
    • 如果有大量的重复 (>3),每个样本 1500 万次 reads 通常就足够了。
    • 如果可能,进行更多的生物重复。
    • 通常建议读取长度 >= 50 bp
  • 含有低表达基因:

    • 同样,重复比测序深度更有作用。
    • 深度更深,至少有 30-60 百万 reads ,具体取决于表达水平。
  • 异构体水平的差异表达:

    • 新亚型的深度应该更大(每个样本 > 6000 万 reads)。
    • RNA 质量进行质控。
  • 其他类型的 RNA 分析(内含子保留、small RNA-Seq 等):

    • 取绝于具体的分析

总之,尽量做生物学重复

3. Confound

Confounding 是指:无法区分结果是由什么原因导致的

例如,我们知道性别对基因表达有很大影响,如果我们所有的对照组小鼠都是雌性而所有处理组小鼠都是雄性,那么我们的治疗效果就会被性别混淆。我们无法区分是处理的作用和性别的作用。

  • 如何避免:
  1. 如果可能,确保每种情况下的动物都是相同的性别、年龄和批次。
  2. 如果不可能,则确保在不同条件下平均分配动物。
deconfound
deconfound

4. 批次效应

批次效应是 RNA-seq 分析的一个重要问题,仅由批次效应就能导致显著的表达差异。

Hicks SC, et al., bioRxiv (2015)
Hicks SC, et al., bioRxiv (2015)
  • 如何确定是否有批次效应
  1. 是否所有的 RNA 提取都是在同一天进行的?
  2. 是否所有的文库构建都是在同一天进行的?
  3. 是否同一个人对所有样品进行了 RNA 提取与文库制备?
  4. 是否对所有样品使用了相同的试剂?
  5. 是否在同一地点进行 RNA 提取与文库制备?

如果任何一个答案是“否”,那么就存在批次效应。

5. 建议

  • 如果可能,以避免分批的方式设计实验。
  • 如果无法避免分批:
  1. 不要按批次混淆实验:
Hicks SC, et al., bioRxiv (2015)
Hicks SC, et al., bioRxiv (2015)
  1. 跨批次拆分不同样本组的重复。重复次数越多越好(超过 2 个)。
Hicks SC, et al., bioRxiv (2015)
Hicks SC, et al., bioRxiv (2015)
  1. 请务必在实验数据中包含批次信息。在分析过程中,如果没有混淆,可以回归出由于批次引起的变异,所以有这些信息,它不会影响结果。

欢迎Star -> Github 学习目录( <-点击跳转)

国内链接 -> 学习目录( <-点击跳转)


分类:

其他

标签:

医学

作者介绍

冷冻工厂
V1

欢迎关注同名公众号“冷冻工厂”