留胡子的豆腐

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2022/03/02阅读:306主题:橙心

mRNA Factory|利用RIboGreen定量检测LNP包封RNA含量

mRNA Factory|利用RIboGreen定量检测LNP包封RNA含量

大家好,我是荷锄同学,Biofactory团队将开设mRNA Factory系列文章,此板块所有的题材全部是收集整理的工艺开发技术资料。通过关键性的细节资料,我们致力于搭建一个生产mRNA的虚拟工厂,这是我们开设这个板块的初衷。分享技术,相互交流,共同成长,是我们一直以来坚持不懈努力的方向。如果大家也感兴趣,愿意分享工作中遇到的技术难点,也欢迎在文章下面留言或者投稿。

为什么我们需要定量检测RNA含量?

确定精确的剂量(accurate dosing)

LNP-RNA制备过程就像是包饺子,RNA是馅,包子皮是LNP,只有知道每个饺子皮包多少克陷,才能知道给病人需要喂几个饺子。在体外试验或者体内治疗时,精确的剂量是非常重要的,因此,我们必需要知道纳米脂质颗粒内部的RNA含量。

包封效率(encapsulation efficiency)

包封率是LNP-RNA非常关键的指标,表示包裹在脂质纳米颗粒内部的RNA占全部RNA的比例。如果LNP-RNA生物学活性很低,那原因可能是多方面的,但是如果可以知道纳米脂质颗粒内部包封的RNA含量是正常的,就可以排除制剂包封过程出现问题。通过包封率的检测,不仅可以摸索LNP配方和包封参数,也能够监测LNP-RNA稳定性随时间发生的改变。

为什么选择RIbogreen作为RNA浓度检测试剂?

Nanodrop检测RNA含量的缺陷

目前最常用的测量核酸浓度的方法是基于光吸收值的方法(absorbance-based method),用Nanodrop检测核酸在260nm处的吸收值(光吸收值和浓度成正比)。基于光吸收值的检测方法有2个主要的缺陷:第一,检测信号水平很容易受到样品中夹杂的污染物的干扰,比如样品里含有的杂质核酸,蛋白以及盐。第二,该方法的检测灵敏度很低(A260=0.1对应样品中的RNA浓度是4 ug/ml)。

RioGreen检测RNA含量的优势

RiboGreen是一种用于定量检测溶液中RNA含量的超敏感荧光核酸染料,检测下限可以低至1 ng/ml,使用96孔板检测时,每孔200 ul样品中可以检测到200 pg RNA。RiboGreen检测的RNA线性浓度范围可以跨越3个数量级,从1 ng/ml到1 ug/ml,并且不会受到样品中存在的蛋白,盐,洗脱剂,乙醇,琼脂糖等杂质的干扰。此外,RiboGreen也可以同样品中的DNA结合,为了消除RiboGreen结合到DNA上产生的荧光信号,在样品中可以加入DNaseI消除样品中存在的DNA。

Moderna公司利用RiboGreen检测LNP包封率
Moderna公司利用RiboGreen检测LNP包封率

RiboGreen检测RNA原理

要检测LNP内部包封RNA的含量,没有直接测量的方法,需要把LNP裂解掉,释放内部的RNA,因此检测与RNA结合的染料产生的信号时,要不会受到溶液中存在的LNP组分干扰。正是基于此,选择RiboGreen作为核酸染料来检测RNA浓度。首先检测LNP-RNA溶液中游离在LNP颗粒外的RNA数量,接着用Triton-100破坏LNP结构,使得RNA释放到外部溶液中,检测出溶液中全部的RNA数量。两者的差值就是被包封在LNP颗粒内部的RNA数量,从而获得包封率。

Riogreen检测LNP包封率流程
Riogreen检测LNP包封率流程

Quant-iT™ RiboGreen® RNA Reagent and Kit

我们以油管Up 主 Precision NanoSystems发布的视频RiboGreen Assay Training Webinar为例,整理使用Invitorgen试剂盒Quant-iT™ RiboGreen® RNA Reagent and Kit来检测RNA浓度具体操作步骤。

首先,来看看,这个试剂盒里有哪些东西?

A组分:1ml RiboGreen RNA染料,注意需要避光保持在4度。

B组分:25ml 20×TE buffer,注意此buffer不含有RNase ,可常温保存。

C组分:RNA标样,浓度是100ug/ml,溶解在TE buffer中,需要放置在-20℃。

Invitorgen试剂盒Quant-iT™ RiboGreen® RNA Reagent and Kit
Invitorgen试剂盒Quant-iT™ RiboGreen® RNA Reagent and Kit

1.制备Buffer

我们需要配制2个buffer溶液。

第1个 Buffer溶液,把20×TE buffer稀释成1×TE buffer。

第2个Buffer溶液,用1× TE buffer 和Triton-100 配制成2% TE-Triton buffer。

制备Buffer
制备Buffer

2.添加LNP-mRNA样品到96孔板

这里涉及到稀释倍数的摸索,需要让LNP-mRNA样品中测到的RNA浓度落到用RNA标样测定的标准曲线范围内。比如,如果标样RNA设定的最高浓度是1000ng/ml,那么你需要根据LNP-mRNA包封时的RNA浓度,大致预测出需要稀释LNP-mRNA的倍数,可以设定一系列梯度稀释倍数进行摸索,找到合理的稀释倍数。

A:测定LNP-mRNA样品中游离mRNA时,用1×TE buffer按照一定比例稀释到100ul。

B:测定LNP-mRNA样品中total mRNA时,需要用2% TE-Triton buffer按照一定比例稀释到100ul。

添加LNP-mRNA样品到96孔板
添加LNP-mRNA样品到96孔板

3.制备线性浓度梯度的RNA标样

试剂盒里提供的标品

试剂盒里RNA标样的浓度是100ug/ml,需要用TE buffer稀释到工作浓度2 ug/ml,然后再用TE buffer稀释到特定浓度,加入96孔板中,每个孔总体积为200ul,100ul 是用TE buffer稀释到特定浓度的RNA标样,100ul是RiboGreen染料。用酶标仪测定标样中荧光强度,激发光在480nm,发射光在520nm。

RiboGreen检测方法RNA标样标准曲线绘制(1ml 标样+1ml RiboGreen)
RiboGreen检测方法RNA标样标准曲线绘制(1ml 标样+1ml RiboGreen)

自己制作标品

当然也可以采用样品RNA作为标准品,RiboGreen Assay Training Webinar视频里先把一定浓度的样品RNA稀释到浓度为20 ug/mL,用nanodrop反复确认。然后用TE buffer把样品RNA从20 ug/mL稀释到10ug/ml,在此基础上,用TE buffer和2% TE-Triton buffer继续稀释为一定浓度梯度的RNA。

采用样品RNA作为标准品,稀释线性浓度梯度
采用样品RNA作为标准品,稀释线性浓度梯度

添加RiboGreen染料

把试剂盒中RiboGreen染料稀释200倍,然后等比例加入到已经加有样品的96孔板中,如果样品有100ul,那么加入100ul RiboGreen染料。加完染料以后,需要孵育5min。

96孔板样品和标准品添加位置
96孔板样品和标准品添加位置

酶标仪读板子

打开酶标仪,设置参数,选择荧光模式,激发光485nm,发射光528nm,读数,记录数据。

酶标仪读板子
酶标仪读板子

数据处理

数据处理,根据标样得到的荧光值和浓度梯度,绘制标准曲线,得到浓度计算公式。把样品荧光值代入浓度计算公式,就可以得到对应的浓度,还需要乘以稀释倍数,才能最后得到样品LNP-RNA中RNA的浓度。包封mRNA浓度等于Total RNA浓度减去游离RNA浓度。

数据处理
数据处理

总结

LNP-RNA包封率的测定方法是在RiboGreen测定RNA浓度的方法基础上做出的进一步改进,加入Triton-100进行破乳,释放LNP内部的RNA,从而测出样品溶液中所含有的Total RNA。该方法测定RNA浓度的关键点在于摸索合适的稀释倍数,保证样品RNA浓度能够落在标准曲线范围内。总体来说,利用RiboGreen测定包封率是一种简单易于操作的方法。

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后端

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