huihui
2023/02/22阅读：49主题：默认主题
综述-空间图谱技术解析肿瘤微环境
综述--空间图谱技术解析肿瘤微环境
文章原名：Spatial profiling technologies illuminate the tumor microenvironment
期刊： cancer cell 发表时间：2023.1.1 通讯作者及单位：Leeat Keren 以色列雷霍沃特魏茨曼科学研究所分子细胞生物学系
概述
由许多细胞和非细胞组分共同构成的肿瘤微环境驱动了肿瘤的生长、侵袭、转移以及对于治疗的响应。越来越多的人认识到肿瘤微环境在肿瘤生物学中的重要性，这使得癌症研究从以癌症为中心的模式转变为将肿瘤微环境作为一个整体来考虑的模式。最近在空间分析方法中的技术进步提供了一个系统的视图，并阐明了肿瘤微环境的物理定位。这篇论文总结了主要的几种空间图谱技术。文章展示了几种技术数据可以展示的不同信息类型以及这几种技术在癌症生物学中的应用、发现以及挑战。最后，文章提供了空间组学如何整合到癌症的研究以改善患者诊断、预后、治疗分层和新疗法的发展的应用前景。
文章背景
肿瘤微环境由许多不同的细胞类型组成，包括恶性细胞和许多非转化的细胞，如成纤维细胞、免疫细胞、神经元、淋巴 和脉管系统。这些细胞类型中的每一种都可以被进一步假设由多种蛋白质的共同表达来定义的不同种表型。这些细胞组织在空间结构的安排显示出微环境龛，营养梯度以及细胞-细胞之间的相互作用。近年来，越来越多认识到这种统称为肿瘤微环境的生态系统，在调节如肿瘤进展和对治疗的反应的复杂现象中起着至关重要的作用。
空间分析方法的最新技术进步有望捕获肿瘤微环境的复杂性，这些方法在保存组织结构的同时也允许测量组织标本中多种蛋白质和转录本的表达。
在这篇综述中，提供了用于组织空间转录组和蛋白质组分析的技术的概述。讨论了这些技术产生的提取信息的类型，并描述了它们的应用、关键发现和在癌症领域的挑战。最后，我们提供了未来对癌症空间分析的观点，描述了未来几年有望探索的新途径，这将允许将空间信息集成到改善患者诊断、预后、治疗分层以及开发新药。
文章主要内容
一系列空间组学分析技术
在过去的十年中，一系列用于原位测量基因组、转录组、蛋白质组和代谢组的技术已经被开发出来。在本文中，我们将这些统称为空间分析技术。在这里，我们专注于空间分析的两种主要模式: (1)信使RNA(mRNA)的空间测量方法和(2)基于抗体的方法来原位测量蛋白质。 为了符合文献中这些技术的通用命名法，我们将前者称为空间转录组学，后者称为多路成像。
一、空间转录组学-空间测量mRNA的方法
虽然有很多空间分辨的转录组方法，但根据它们的检测策略，一般可以分为两大类。大多数空间转录组技术使用空间索引或基于成像的方法来原位测量和量化mRNA分子。
1.1 空间索引方法
空间索引方法使用条形码局部杂交到RNA分子，然后使用二代测序对基因表达 谱进行量化。简言之，简单地说，一个包含独特的条形码寡核苷酸(dT)引物 (斑点)的阵列集群被组织部分覆盖。组织渗透允许原生RNA分子从组织扩散到 阵列，并与这些条形码杂交。RNA分子然后直接在片上进行cDNA合成，然后进行 组织消化和去除。cDNA片段连同它们所附的条形码汇集在一起测序，生成基因表达谱，可以使用条形码映射回它们的空间坐标。因此保留了空间的信息。不同的索引技术在条形码的空间分布方式上存在差异，使用打印斑点(如ZipSeq)、beads(如Slide-seq、Drop-seq、HDSTHDST [high-definition spatial transcriptomics])、聚类阵列(如ST[spatial transcriptomics]、Seq-Scope)、微孔(如XYZeq)、DNA纳米球(如Stereo-Seq)。 
条形码斑点的大小和密度决定了基因表达谱之间的分离分辨率。这些方法的分子捕获分辨率在500~0.25毫米。当捕获分辨率大于单个细胞大小时，例如在10x visium和Slide-seq等方法中，就需要推断特异的细胞类型，细胞类型的鉴定是使用斑点反褶积或单细胞RNA测序(scRNA-seq)集成的基因表达特征完成的。具有亚细胞捕获分辨率的方法，如Seq-Scope和 Stereo-seq,保留了单细胞分辨率，但面临数据稀疏性和难以确定细胞边界的挑战。总之，基于空间索引的方法在能够以无偏倚的方式探测整个转录组，而不需要事先知道测量哪些基因。但是由于空间索引依赖polyA杂交，这些方法的挑战是组织中mRNA的完整性，在新鲜冷冻和福尔马林固定的石蜡包埋(FFPE)样品之间可能有所不同。这是癌症研究的一个重要考虑因素，因为临床样本通常被保存为石蜡包埋(FFPE)块。此外，实现单细胞分辨率仍然是一个技术和计算上的挑战。
1.2 成像方法
基于成像的方法使用原位荧光标记mRNA 分子和高分辨率荧光显微镜 来检测和区分单个mRNA转录本。多路复用是通过执行标记、成像 和信号去除的循环来实现的，其中不同的方法在这些基本步骤的实现中有所不同。基于成像的方法的一个主要挑战是mRNA丰度在原位是低的，经常会被降解。因此，从少量分子中产生特定的、明亮的和稳健的荧光信号需要信号放大。因此，不同方法之间的变化的根源是信号放大的解决方案。 
为了放大来自单个mRNA分子的信号，习惯在目标RNA上构建分子支架，为荧光标记提供更大的可寻址序列。这可以用酶、杂交或两者的结合来完成。例如，原位测序方法使用挂锁探针结合mRNA或反向转录的cDNA，以创建合成条形码序列或部分基因序列的局部扩增。不同的方法使用特定组合进行原位cDNA合成，滚环扩增复制(例如，ISS [in situ sequencing]，FISSEQ[fluorescent in situ sequencing]，PLISH[proximity ligation in situ hybridization])，RNA模板DNA连接酶(例如，BOLORAMIS[barcoded oligonucleotides ligated on RNA amplified for multiplexed and parallel in situ analyses])，47个定制锁探针(例如， [barcode in situ targeted sequencing]，SCRINSHOT [single-cell-resolution in situ hybridization on tissues]，ExSeq [expansion sequencing]，STARmap[spatially resolved transcript amplicon readout mapping])以及扩展显微镜。基于杂交的方法通过在mRNA上拼接多个探针来进行无酶信号扩增， (e.g., MERFISH [multiplexed error-robust fluorescence in situ hybridization], SeqFISH [sequential fluorescence in situ hybridization], split-FISH, osmFISH [ouroboros single-molecule fluorescence in situ hybridization], EASI-FISH[expansion-assisted iterative fluorescence in situ hybridization])，使用预先合成的扩增结构，如分支DNA(e.g., RNAScope)，进行轮次连续的杂交反应，(e.g., HCR [hybridization chain reaction], SABER-FISH [signal amplification by exchangereaction fluorescence in situ hybridization])or click chemistry (e.g., ClampFISH [click-amplifying fluorescence in situ hybridization])。
在预扩增之后，通过连续多轮的成像来解码mRNAs。这里的方法有所不同但大致可以被分为两类。第一类使用合成测序或连接测序对条形码或放大的mRNA序列进行基于光学的测序。结果是一段可以被匹配到特定mRNA序列上的DNA序列。虽然在大多数方法中， 是一个合成的条形码序列，但在一些方法中， 序列源自mRNA本身，这使得识别剪接变体、突变、snp等成为可能。第二类使用荧光标记探针与扩增的mRNA杂交。结果是荧光开关模式，反过来，代表单个mRNA的条形码。
** 二、空间复合蛋白质组学 **
原位蛋白质组学可以分为非靶向方法和使用抗体的靶向方法。大多数靶向复合蛋白质组学技术使用类似于显微镜技术的实验程序进行抗体染色。方法的性质不同 的部分在于附着抗体、包括荧光团、酶、DNA寡核苷酸，和金属同位素。一般来说分为基于显微镜的方法和基于质量谱的方法。
2.1 循环显微镜法
由于光谱重叠，光学显微镜和荧光显微镜可以同时探测到少量的目标。为了增加成像目标的数量，循环显微镜方法执行包含以下几个步骤的循环过程的变化:(1)用标记抗体进行组织染色，(2)图像采集;(3)信号失活或去除。对这个基本序列进行迭代可以增加成像蛋白质的数量，但也存在几个挑战：首先，这个过程很耗时，可能会阻碍高通量。其次，组织和表位的完整性可能会在循环中下降。第三，由于不完全去除，一个周期的信号可以传递到另一个。不同的方法在于 如何通过修改染色过程和去除上一个染色的结果来解决这些挑战。
多重免疫组化(mIHC)包括连续多轮显色染色和成像，随后进行信号清洗和抗体剥离。在这种方法中，每个周期成像一个抗体，并证明其可以应用于12种不同的抗体染色。多重免疫荧光方法使得在每个循环中用标记不同荧光团的几种抗体染色成为可能，从而增加了每个循环成像的蛋白质数量，总共可以达到数十种蛋白质。这些方法大多使用一级荧光团标记的抗体，它们在荧光团信号去除的方式不同，基于化学去除(MxIF [multiplexed fluorescence microscopy]，IBEX [iterative bleaching extends multiplexity])光漂白(MELC[multi-epitope ligand cartography])，它们的组合(t-CyCIF[tissue-based cyclic immunofluorescence])，或促进标签释放的工程抗体(MICS)[MACSima imaging cyclic staining])。为了放大信号，可以使用与一抗(4i)耦合的荧光团标记二抗。将显微镜连接到自动微流体系统，执行染色和去除阶段，减少了操作时间，提高了组织完整性。
为了减少与多重成像相关的时间，不同的方法将循环染色或成像统一为一步。例如，几种方法使用带有特异的DNA寡核苷酸标记的一抗。这使得只需进行一次抗体杂交的漫长过程，然后使用荧光寡核苷酸探针或与荧光脱氧核苷三磷酸(dNTPs)聚合(例如DEI [DNA exchange imaging]和CODEX[codetection by indexing]进行更短的标记、成像和信号去除周期成为可能。DNA标记抗体的信号也可以使用连续杂交反应(例如，e.g., Immuno-SABER)进行扩增。另一种允许信号放大缩短实验步骤长度的方法是tyramide 信号放大(TSA)。在每个循环中，多个tyramide连接的荧光团分子共价结合到组织中导致在一个稳定的放大信号中，并可以使抗体剥离。将TSA与光谱分离的荧光团相结合，这种方法允许在所有染色周期完成后，可以在单个图像采集阶段检测多达8个目标。
2.2 质谱方法
这组方法使用抗体附着在独特的金属同位素上，可以用质谱法进行区分。抗体用金属标签标记，然后在一个单一的反应应用于组织染色。为了获得空间信息，将 组织划分为密集网格，并使用质谱法读取每个像素所有目标蛋白的表达。方法不同在于如何从组织中提取金属 ，使用二次电离(MIBI[multiplexed ion beam imaging], MIBI-TOF [time of flight], HDMIBI [high-definition MIBI],)or激光消融(IMC [imaging mass cytometry])，并且在质谱仪中，包括磁性部分 (MIBI, HD-MIBI) 或者 time of flight (MIBI-TOF,IMC)，与基于显微镜的方法不同，这些方法对组织具有破坏性。
总之不同的方法在其复合能力、简单性、分辨率、成本、检测低丰度信号的能力、与临床标本的兼容性以及动手操作以及使用仪器时间方面都有所不同。
空间图谱技术在癌症生物学中的研究*
空间分析技术的输出是描述每个蛋白质或 RNA转录本的空间表达模式的多维图像。因此这些数据集非常庞大，通常可以扩展到数万张图像。这组图像包含多层信息，包括单细胞表型、单细胞形态、组织中细胞的组成、它们的近距离相互作用、它们组成多细胞结构以及解剖结构的形成。然而，从原始数据中提取这些特征并不简单，需要专用的分析方法，连接显微镜、病理单细胞分析和计算机科学的世界。 
单细胞分析和细胞组成
空间图谱数据包含关于组织中单细胞的身份和表型的信息。虽然细胞组成可以在单细胞分辨率数据的基础上进行量化，但空间分析在量化细胞组成方面提供了几个优势，甚至在忽略空间方面时。首先，根据技术的不同，人们可以分析存档的FFPE组织，而基于悬浮液的技术通常需要新鲜的组织。这使得研究人员可以推断存档标本的细胞组成，增加了可以分析的长期临床标本的数量。其次，成像不需要组织消化，组织消化可能导致对不同消化条件敏感的特定细胞类型的差异损失(例如，粒细胞)。第三，成像使表征细胞外成分以及坏死和纤维化区域成为可能。总之，空间分析技术会加速在癌症中大规模和系统的评估细胞成分。
为了从空间分析图像中提取鉴定细胞成分信息，执行以下几个分析步骤：在提供单细胞分辨率的方法中，细胞首先在核、细胞质或膜染色的基础上进行分段。新的分割方法大多依赖于人工训练数据来预测细胞边界，使用监督机器学习；分割后，每个mRNA或蛋白质的表达被分配到每个细胞，生成表达矩阵，类似于从单个细胞图谱分析中获得的表达矩阵，例如流式细胞仪、海量细胞仪或scRNA-seq；接下来，使用聚类和分类算法或手动顺序门控策略将细胞分类为细胞类型，类似于流式细胞术的分析。在不提供单细胞分辨率的方法中，例如 ，一些空间索引转录组方法，细胞组成是通过反卷积每个点的基因表达剖面来推断的。反卷积模型通常需要每种细胞类型的表达谱，这可以从相同或类似组织的scRNA-seq数据中获得。反卷积的算法实现上有所不同，方法包括使用非负矩阵分解概率，图表，和深度学习等。
在癌症生物学中的发现
通过空间分析实体肿瘤的细胞组成突出强调了其复杂性，包括肿瘤、免疫和基质细胞亚型。其中许多研究集中在描述免疫微环境。通常，巨噬细胞和CD8+细胞毒性和CD4+辅助T细胞是在各种癌症类型中发现的最丰富的免疫细胞，而其他T细胞，自然杀伤(NK)细胞，B细胞和粒细胞的数量较低。 然而，在患者中，免疫浸润是高度可变的，变异横跨从免疫冷肿瘤很少或没有免疫细胞到强烈浸润肿瘤。包括头颈部鳞状细胞癌和胰腺导管腺癌(PDAC)在内的各种肿瘤图谱始终以白细胞为基础分为三组：髓样增生，淋巴样增生，轻度炎症。
在多个肿瘤中绘制细胞类型组成可以检查它们在肿瘤微环境内的共同发生。有趣的是，这种方法在几种癌症中揭示了类似的免疫细胞组成的分级顺序，包括黑色素瘤和三阴性乳腺癌。肿瘤微环境中B细胞的存在几乎总是伴随着辅助细胞和细胞毒性T细胞。同样，T细胞亚型的存在伴随着巨噬细胞或单核细胞。 这表明对肿瘤的协调免疫反应，反映了免疫细胞到肿瘤部位的分层招募。
肿瘤的细胞组成也由构成肿瘤的细胞的表型或状态来定义。虽然细胞类型的组成通常由谱系基因的表达表征，但细胞状态由功能基因的共表达模式定义。例如，在乳腺癌中，以细胞角蛋白、激素受体和生长因子受体 表达为特征的肿瘤细胞表型来反映临床亚型。成纤维细胞亚型的转变，从静止到癌症相关的成纤维细胞，与导管原位癌向浸润性乳腺癌的转变有关。T细胞和巨噬细胞的功能状态已经根据激活和抑制分子的共表达模式被定义，并与亲肿瘤和抗肿瘤免疫反应相关。例如，透明细胞肾细胞癌表现出多种由PD-1、CTLA-4、TIM-3和ICOS组合表达的T细胞亚型。此外，在这些肿瘤中，巨噬细胞群体表现出连续的表型，其中CD38+CD204+CD206-亚群与免疫抑制环境相关。总的来说，细胞组成的分析提供了关于肿瘤微环境中存在哪些细胞的信息和它们的表型和共现。
细胞相互作用和微环境生态位
除了关于细胞类型的组成和状态的信息外，空间分析技术还包括关于其物理位置的信息。这使得绘制组织中的多细胞结构成为可能，并为单细胞表达表型提供上下连接。空间分析中的一个挑战和机遇是空间组织跨越各种连接的长度尺度，包括直接相互作用，居住在共享微环境生态位的细胞之间的近距离相互作用，以及组织成微解剖结构。
为了推断空间组织的各个层次，可以通过自顶向下或自底向上的方法进行分析。自上而下的方法侧重于特定的解剖结构，根据基础上的先验知识或组织学界定前缘，肿瘤核心和边界。然后识别这些不同区域的独特特征，包括基因表达、细胞组成和相互作用等。在自下而上的方法中，组织内反复出现的短期模式被识别，以推断高阶组织结构。这些方法分为评估成对相互作用和评估多细胞相互作用的方法。配对相互作用通过识别细胞对、 mRNAs或蛋白质，显著共定位在组织中的情况。这种分析中的一个挑战是确定这些相互作用中哪些是重要的，并将它们与由居住在同一微解剖结构中的两种细胞类型所产生的相互作用分离。限制分析预先定义的细胞类型、组织学结构、或已知的配体-受体对可以富集直接相互作用。
多细胞相互作用的分析揭示了复杂的模式，可能涉及两种以上的细胞类型。这些 富集模式在文献中被称为细胞小区、壁龛、群落、微环境或隔间。识别微环境生态位的常用方法包括通过其细胞组成聚类区域，并将社区检测算法应用于细胞连通性图。或者可以直接聚类空间定义的基因表达谱或基因模块。总而言之，将空间方法应用于大型组织切片，可以识别之前无法用组织学或病理信息识别的以多细胞相互作用为特征的新区域，并且空间组学的方法通常更多的细节信息。
细胞相互作用和微环境生态位在癌症生物学中的发现
近距离
利用空间分析技术对癌症中的近距离相互作用进行分析，揭示了细胞组织的一般原理。细胞相互作用大致分为同型(相同的细胞类型和表型)和异型(不同的细胞类型和表型)相互作用。在不同类型的癌症中，同型相互作用的富集是一种反复观察到的现象。例如，将细胞相互作用与乳腺癌亚型联系起来，揭示了基底样肿瘤中丰富的上皮和间质同型相互作用，反映了这些隔室之间的分离。这些发现强调了肿瘤中的空间模式，并指出了定位于微环境龛的生物活动模式。之前研究观察到结直肠肿瘤中来自相同代谢途径的蛋白质在空间上富集，显示出具有独特 局部代谢活性的微环境生态位。
在肿瘤微环境中中也描述了异型相互作用。具体来说，一些研究确定了以几种细胞群(主要是T细胞和巨噬细胞)相互作用为特征的免疫抑制微环境的存在。例如，乳腺癌中的增殖抑制微环境生态位显示，表达免疫检查点蛋白(如PD-1)的淋巴细胞和巨噬细胞富集了调节性T细胞。类似地，一组高危结直肠癌患者表现出增殖调节性T细胞和巨噬细胞富集的抑制微环境。进一步的研究发现，表达MRC1和CCL18的免疫抑制巨噬细胞与结直肠癌肝转移中的肿瘤细胞或与表达PD-L1和IDO1的髓系细胞与乳腺癌中的肿瘤细胞之间存在异型相互作用。
也有研究确定了由独特的肿瘤细胞群形成的异型相互作用。例如，在鳞状细胞癌中，一个特定的肿瘤细胞群表现出侵袭性基因表达特征，在与成纤维细胞、内皮细胞、巨噬细胞和骨髓来源的抑制细胞形成广泛的自分泌和旁分泌相互作用的基础上，被确定为细胞间通信枢纽。同样在PDAC中，表达应激反应基因的特定癌细胞亚群与表达IL-6的炎性成纤维细胞共定位，而其他癌细胞群则没有这些特征，证明了局部细胞通讯网络和肿瘤细胞表型之间的相互依赖性。
大规模的/大尺度的
肿瘤微环境内的大规模细胞组织表现为不同的空间定义的隔间和微解剖结构，可以在特定的细胞类型中显示富集。肿瘤通常组织成肿瘤室( 主要由肿瘤细胞组成)和基质室(主要由免疫细胞、成纤维细胞和细胞外基质(ECM)组成)。 事实上，PDAC肿瘤显示出间质室中淋巴细胞和髓系细胞的富集以及肿瘤室的免疫排斥。在三阴性乳腺癌(TNBC)中，确定了两种亚型的组织组织模式:一些肿瘤在肿瘤和免疫细胞之间表现出区隔化，但其他肿瘤表现出这些细胞类型的混合组织。
肿瘤微环境中间隔之间的接口定义了边界或前缘，与驻留在间隔内的单元不同，这些边界始终显示为特定的单元。例如，一项比较皮肤鳞状上皮细胞癌和匹配的正常皮肤的研究发现了癌症特有的肿瘤特异性角质形成细胞群，定位于肿瘤前沿的纤维血管小位。与侵袭性表型一致，这些细胞表现出与细胞运动、 ECM分解和上皮细胞到间充质转化相关的基因表达特征(EMT)。类似地，乳腺癌肿瘤在肿瘤间质边界显示肌成纤维细胞的富集和淋巴细胞的减少。在TNBC中，肿瘤-免疫边界被确定为表达PD-L1的髓系细胞和肿瘤细胞上富集表达MHCII的免疫抑制位点。这些结果表明，成纤维细胞和巨噬细胞在支持肿瘤边界方面可能是必不可少的。
三级淋巴结构(TLSs)是一种微解剖结构，已在广泛的癌症类型中被确定。它们的结构类似于淋巴滤泡，其富含B细胞的内区被T细胞包围，由其他细胞类型填充，包括不同的树突状细胞群、巨噬细胞和成纤维细胞。TLSs被认为是产生或增强适应性免疫反应和淋巴细胞募集的位点。将高度复用的空间方法应用于TLSs，可以深入表征其组成和抗肿瘤免疫中的作用。例如，Meylan等人发现，产生IgG和iga的浆细胞在肾细胞癌(RCC)中通过TLSs阳性肿瘤中的成纤维细胞轨道扩散。Hoch等人研究了黑色素瘤中趋化因子表达的空间分布，发现CXCL13参与B细胞卵泡成熟的TLS依赖性梯度。此外，本研究还发现TCF1+CD8+原始的T细胞在TLSs中富集，这表明TLSs可能是这类细胞的启动位点，这对抗肿瘤免疫很重要。
将空间组织模式与肿瘤生物学、遗传学和临床特性联系起来
对肿瘤微环境的空间描述本身是有价值的，但最重要是揭示导致这些组织模式形成的机制以及它们的功能和临床意义。为了回答这些问题，有必要将空间分析技术与仔细注释的患者队列、附加数据 和良好控制的扰动集成在一起。
一些研究表明，肿瘤之间的固有遗传差异与肿瘤微环境的组成和组织相关。 在乳腺癌方面的工作显示了乳腺癌的遗传亚型和特定的基因组改变与不同的微环境生态位相关联。例如，腔内A肿瘤丧失了免疫抑制环境，该生态位在雌激素受体(ER)阴性肿瘤中最为丰富。BRCA1和Casp8突变也与免疫抑制生态位相关;而B2M的缺失与TLSs相关；CD274 (PD-L1)的增加与TLSs相关。这些关联揭示了肿瘤遗传学和肿瘤微环境之间的紧密联系，相互共同塑造。
小鼠模型提供了操作微环境中不同组成成分的工具，可以提供机制研究和确定肿瘤微环境中肿瘤细胞和其他细胞类型通信的因果关系。最近的一项 研究强调了这一点，该研究确定了15种癌症类型的复发癌细胞状态。通过将scRNA-seq与空间转录组学相结合，在肿瘤细胞与T细胞和巨噬细胞中发现了干扰素反应状态的共定位。然而，在缺乏淋巴细胞的小鼠中，干扰素反应模块减少而其余状态没有改变。其他研究在将癌细胞系或异种移植接种到小鼠体内之前，操纵了它们的突变，并发现驱动突变PTEN缺陷可以影响肿瘤微环境中其他细胞的生长。将小鼠模型与空间分析技术相结合，还可以研究治疗对不同肿瘤区室内细胞相互作用和细胞组成的影响。例如，KRAS抑制小鼠原位肺癌导致F4/80+CD206+MHC-IIhighCD86high巨噬细胞亚型的扩增以及与树突状细胞和成纤维细胞相互作用。并且治疗导致T细胞迁移到肿瘤区域并改善肿瘤血管化。这些结果证明了那些被认为主要具有细胞自主作用的药物，如抑制突变的KRAS，也会改变免疫反应，例如通过将T细胞、巨噬细胞和肿瘤细胞一起带到同一室。
除了小鼠模型外，肿瘤外植体是另一个有价值的工具，用于研究治疗对肿瘤空间组织的影响。结合靶向分泌组分析和抗cd47和/或抗pd-1治疗的胶质母细胞瘤外植体的多重成像，确定了一个诱导诱导IFN-g表达的外植体子集。这些外植体可能代表“反应者”，表现出CD4+和CD8+ T细胞增加，IFN-g 反应和肿瘤中心的空间免疫细胞重排，但在外围没有。
最后，将空间分析技术应用于大型队列，并带有注释的临床信息，可以将肿瘤微环境与肿瘤的进展、生存和对治疗的反应联系起来。在许多病例中，与单独从细胞类型频率中获得的信息相比，这些关联在空间信息集成上表现得更好，强调了肿瘤空间特征的重要性和临床意义。在一项比较预测因素与抗pd -1/PD-L1治疗的临床反应 的meta-分析中，与传统的PD-L1免疫组化、肿瘤突变负担或大量基因表达谱相比，多重免疫组化和免疫荧光具有更高的诊断准确性。在另一个例子中，Risom 等使用从多重成像提取的特征来训练机器学习模型，以预测从导管原位癌到浸润性乳腺癌的进展。对细胞类型和状态、组织间隔富集、细胞-细胞接近性和形态测量学等特征进行训练，他们发现预测进展的前20个参数中有15个是空间指标。综上所述，这些发现强调了空间特征在患者预后中的重要性。
肿瘤微环境中细胞之间的特定相互作用也被发现可预测各种癌症类型的预后或治疗反应。在高级别浆液性卵巢癌中，Zhu等人确定了120种与生存相关的最近邻细胞-细胞相互作用，包括颗粒酶B+细胞毒性T细胞和多种肿瘤细胞亚型的相互作用。SpatialScore计算了CD4+T细胞与肿瘤细胞、CD4+T细胞与T调节性 细胞之间的距离比，这种距离比与皮肤T细胞淋巴瘤抗pd-1治疗的反应相关。几种癌症类型的进一步研究表明，免疫细胞亚型与肿瘤细胞的距离与患者预后之间存在关联。 在乳腺癌中，四种类型的微环境生态位被描述为与生存相关， 与以细胞增殖为特征的生态位以及与最差预后相关的调节性和功能失调的T细胞相关。
总而言之，这些与临床结果的关联强调 肿瘤微环境中的空间特征和组织模式包含有价值的信息，具有重要的临床意义，这些信息可以在未来用于患者的诊断或分层，以进行量身定制的治疗。
空间组学在癌症研究中应用的挑战
空间分析在癌症中的应用有望解开肿瘤微环境的结构和功能，但该领域仍处于起步阶段，需要克服多个大的个挑战才能释放其全部潜力。目前可用技术的最大挑战之一是有限的通量。癌症相关研究需要大的队列规模以克服肿瘤间和肿瘤内的异质性，并获得有意义的结果。增加的生物和环境异质性与患者护理的可变性以及处理组织样本的技术差异相关联，在小鼠模型的实验中也是如此，并且这种异质性在人类患者的肿瘤中急剧加剧。然而，由于许多空间分析技术依赖于新开发的技术，其通量相对于该领域的需求仍然有限。，取决于具体的技术有几个因素共同限制了空间分析的通量。大多数情况下，在这些因素之间存在权衡，每个因素都发挥着或大或小的作用。一个主要因素是基础设施和仪器的高成本以及试剂和消耗品的高成本。因此，为了降低成本，学生人数往往会受到影响。一个增加队列大小同时保持成本在一个合理的水平的解决方案是是使用组织微阵列，这可以在一个组织块研究大量的样本。然而，这损害了每个样本的组织切片 面积，结果可能因肿瘤内异质性而扭曲。目前限制空间分析实验通量的另一个重要因素是时间。时间可分为实验前投入的时间、实验中操作时间、仪器时间和分析时间。迄今为止，许多空间分析技术在进行实验之前需要大量的时间投入。例如，它需要时间和专业知识来设计良好的探针和基于探针的mRNA分析的稳定的条形码方案。在基于抗体的多路成像方法中，需要花费时间和精力来验证抗体 克隆与所使用的标签偶联和多路染色条件兼容。将抗体池组合到 面板中也是耗时的，因为循环荧光中成像周期或基于质量的方法中的通道之间存在干扰。
在未来，我们可以期待看到技术、分析、和程序方面的发展，这将大大缩短空间分析实验各个阶段的时间框架。增加与空间分析兼容的试剂的可用性将极大地促进该领域的发展。例如， 虽然分泌因子如白介素和趋化因子 对癌症细胞通信网络的特征具有重要意义，但在原位检测它们的抗体的可用性通常是有限的。同样，与癌症研究高度相关的磷酸化或突变蛋白质的检测，也受到抗体可用性和质量的限制。 
所有现有技术在成本、时间和技术性能之间都有内置的权衡，空间分辨率、测量的mRNA或蛋白质的数量以及结果数据的质量，包括特异性和敏感性，也在不同技术之间相互平衡。例如，在大多数技术中，增加空间分辨率是可能的并有望提高数据的质量，但目前需要增加成像时间或成本。类似地，使用预校准的试剂可以加快实验，但往往限制了所分析的分子目标的数量和种类。
随着空间分析技术的不断发展，我们可以期望这些权衡最小化:用更少的钱和更短的时间获得更好的数据。现有技术的改进将允许通过物理减小像素尺寸或应用组织扩展协议来提高亚细胞区室详细描述的分辨率。此外，对于以显微镜和质谱为基础的方法，通过开发新的标签和压缩/解压算法，可以可视化比现有标签数量多的分子，这有望提高复合能力。因为一些组织组织模式可能无法在二维中检测到，组织的三维剖面将提供更准确的肿瘤微环境视图。一些研究已经通过利用水凝胶-组织化学或蛋白质(使用组织清除)，组织的连续切片或提高离子束成像的分辨率证明了mRNA的多重三维表征。
展望空间组学在癌症研究中的应用
空间分析领域正在迅速发展，其中包括数据模式的整合，与临床的整合和大规模的基于社区的数据共享努力等方面引人注目。最令人兴奋的途径之一源于空间分析与快速发展的计算机视觉和人工智能领域的结合可能性。随着基于深度学习的算法的引入，计算机视觉领域在过去十年中取得了前所未有的发展，这种算法可以通过处理图像来识别个体，解释他们的面部表情并驾驶汽车。类似的算法越来越多地用于从放射学到电子显微镜等生物和医学图像分析的各种任务。将计算机视觉算法应用于H&E染色的组织，已经证明了与预后和遗传畸变相关的自动学习的空间和形态特征，突出了其在分析多重空间数据方面的潜在应用。空间分析技术生成大量的数据集很难手动处理。深度学习需要大量数据进行训练。将两者结合有可能导致新的发现，这可以转化为临床生物标志物和治疗。深度学习已经加速了分析过程中的例如细胞分割和分类等特定阶段。随着空间分析数据集的积累，我们可以期望看到深度学习在分析中发挥关键作用。
为了将空间分析与支持深度学习的计算机视觉集成起来，有必要为数据分析、存储、集成和共享构建标准化的基础设施。空间剖析技术输出大的多维文件，它们的大尺寸限制了数据共享。通过自动化和一致的处理管道实现数据生成和文件格式的标准化，以及用于存储的专用web服务器浏览对于推动计算创新和生物学见解都至关重要。作为标准化和共享数据努力的一部分，我们可以预期空间分析技术将在大规模社区工作中发挥重要作用，以绘制健康和疾病中的组织，包括人类细胞图谱、人类生物分子图谱计划和人类肿瘤图谱网络。
随着该领域的发展，我们可以期待技术的进步，这将使绘制更详细的组织成为可能。新的发展将允许分析来自所有组学领域的广泛分子成分的空间分布。包括表观基因组、外延转录组、分泌组、T细胞受体库、微生物组等。新的技术已经开始描述染色质结构，可及性，组蛋白修饰和翻译组。
虽然在这篇综述中描述的任何一种分子成分的空间映射都产生了有价值的发现，但在同一项研究中集成这些技术可以将它们连接起来，多层次的信息有助于深入了解机制和功能。例如，基因组的空间特征结合基因表达可以为基因型对表型的影响以及癌症中遗传和微环境效应的解耦提供深入的见解。方法的整合可以是连续的，也可以是单个组织切片。后者需要开发适合于描述一种以上分子成分的方案。这是具有挑战性的，因为组织处理条件不同。尽管如此，mRNA转录物和蛋白质的多重表征的论文已经发表，我们期待未来更多的综合实验方案的发展。
除了技术的集成，随着空间分析技术绘制肿瘤微环境的详细程度不断提高，关键的下一步将是建立实验系统，使功能性地研究这些细胞生态系统成为可能。与敲除特定基因或过度表达以评估其在过程中功能作用的实验类似，我们需要如类器官系统这样体外控制细胞组装的方法，从而能够精确控制肿瘤中单个细胞的组成、状态和组织的实验系统。
值得注意的是，对这样一个系统的相关扰动是什么还不清楚。我们是否完全移除一种细胞类型?我们改变细胞的状态了吗?还是我们向生态系统引入了一种不同的细胞类型?虽然我们还没有这些复杂问题的答案，接近肿瘤微环境作为一个相互作用的细胞的生态系统，影响彼此的功能，当然为“下一代”癌症研究提供了令人兴奋的机会。
利用空间分析技术的全部潜力进行癌症研究的一个重要前言是与临床的合作。将空间分析应用于具有丰富的临床数据的大型队列将是至关重要的。为此空间分析技术必须与临床实践和工作流程兼容。例如，临床样本通常作为FFPE组织保存，但是大多数空间转录组方法最初是为新鲜冷冻组织开发的。
最后，空间分析技术揭示了肿瘤生态系统中的细胞相互作用和微环境。已有研究表明，这些特征与患者的临床结果相关。因此，我们预计在不久的将来，将引入新的生物标志物用于诊断，将患者分层并根据几种蛋白质/基因之间的相互作用进行量身定制的治疗方案。此外这些微环境的研究结果可以促进相关联合疗法或针对相互作用蛋白质的双特异性抗体的开发。最后，我们期待空间分析技术将继续发展，提高我们对肿瘤微环境的理解，并在未来几年在癌症研究和临床治疗中发挥重要作用。
原文链接：https://doi.org/10.1016/j.ccell.2023.01.010
。
作者介绍