🤩 scRNA-seq | 吐血整理的单细胞入门教程（初步Normalization）（十）

1写在前面

之前我们在质控（QC）篇介绍了Normalization的重要性。😘
scRNAseq是一个高维度的数据，相对比较复杂，不同细胞，不同平台,相差较多，所以library大小差异较大，我们需要做一个Normalization，常用方法包括：👇
UQ, SF, CPM, RPKM, FPKM, TPM。🤒

Note! 如果你使用的是Cufflinks或者RSEM进行定量。
恭喜你, 不需要normalization,因为这类方法已经考虑到的library大小不同的问题了。

2用到的包

rm(list = ls())
library(tidyverse)
library(SingleCellExperiment)
library(scater)
library(scran)
library(scRNA.seq.funcs)

3示例数据

这里我们用一下之前介绍的counts文件和annotation文件，然后通过SingleCellExperiment创建SingleCellExperiment格式的文件，并且经过初步过滤，ID转换等。

load("umi_umiqc.Rdata")
umi.qc

4PCA-rawdata

这里我们用取过log后的raw_counts进行PCA绘图。

umi.qc <- runPCA(umi.qc, exprs_values = "logcounts_raw")
plotPCA(umi.qc, colour_by = "batch", size_by = "detected", shape_by = "individual")

5PCA-CPM

这里我们先做一个CPM，然后取log,再做一下PCA。 聚类明显要好一些了！😂

logcounts(umi.qc) <- log2(calculateCPM(umi.qc) + 1)
umi.qc <- runPCA(umi.qc)
plotPCA(umi.qc, colour_by = "batch", size_by = "detected", shape_by = "individual")

6RLE-rawdata

这里我们引入一个新的可视化方式，叫relative log expression (RLE) plots。
先对raw_counts做一个RLE plots吧, 这里可以看出有明显批次效应。

plotRLE(umi.qc, exprs_values = "logcounts_raw",colour_by = "batch") + ggtitle("RLE plot for logcounts_raw")

7RLE-CPM

再看一下CPM后的结果吧，非常明显！🥳

plotRLE(umi.qc, exprs_values = "logcounts",colour_by = "batch") + ggtitle("RLE plot for log2(CPM) counts")

8其他方法

基于CPM的Normalization方法，或者其他类似的方法，有一个前提，就是假设所有细胞含有相似数量的RNA，但这有时候是不对的。🤒
这里我们介绍一下scran包，通过反卷积的方法进行Normalization。🤗

8.1 聚类

qclust <- quickCluster(umi.qc, min.size = 30)
table(qclust)

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8.2 计算sizefactor

接着我们来计算一下sizeFactor，用于后面的Normalization。🧐

umi.qc <- computeSumFactors(umi.qc, clusters = qclust)

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8.3 正式Normalization

开始log和Normalization。🤩

umi.qc <- logNormCounts(umi.qc)

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8.4 可视化-PCA

umi.qc <- runPCA(umi.qc)
plotPCA(umi.qc, colour_by = "batch",size_by = "detected", shape_by = "individual")

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8.5 RLE plot

plotRLE(umi.qc, exprs_values = "logcounts",colour_by = "batch")

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8.6 补充一下

如果你已经做过Normalization，再做一次的话，这个size factors会是负数，严重影响你的结果。🫠
我们可以check一下。✌️

summary(sizeFactors(umi.qc))

9downsampled data

这里再介绍一个scRNA.seq.funcs包的Down_Sample_Matrix函数。
采用了downsample，降采样的方法，具体概念不介绍了，大家自行google。

9.1 PCA

logcounts(umi.qc) <- log2(Down_Sample_Matrix(counts(umi.qc)) + 1)
umi.qc <- runPCA(umi.qc)
plotPCA(umi.qc,colour_by = "batch",size_by = "detected", shape_by = "individual")

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9.2 RLE plot

plotRLE(umi.qc, exprs_values = "logcounts",colour_by = "batch")

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最后祝大家早日不卷!~

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需要示例数据的小伙伴，在公众号回复scRNAseq获取吧！

点个在看吧各位~ ✐.ɴɪᴄᴇ ᴅᴀʏ 〰