泰国玛希隆大学开发嵌合Spike环状新冠mRNA疫苗

2022年3月28号，泰国玛希隆大学Patompon Wongtrakoongate组在BioRxiv上传预印本文章：Broad neutralization of SARS-CoV-2 variants by circular mRNA producing VFLIP-X spike in mice，开发出一款广谱型的环状新冠mRNA疫苗，采用VFLIP Spike抗原设计，同时引入来自VOCs的6个突变，能够触发靶向各种VOCs的广谱型血清中和抗体和偏向TH1的细胞免疫反应。与目前广泛使用的S-2P Spike抗原相比，VFLIP Spike抗原拥有更加接近天然Spike的糖基化位点，更好的稳定性。在基于结构理性设计的抗原基础上，构建嵌合突变Spike，同时结合环形RNA平台，为迭代mRNA疫苗的开发提供非常好的思路。

抗原设计

在抗原设计上，研发人员采用Erica Ollmann Saphire基于结构设计的Spike抗原—VFLIP。与S-2P/S-6P相比，VFLIP不仅表达量和稳定性得以显著提升，更加重要的是同天然Spike具有相同的糖基化位点。VFLIP抗原，在Spike蛋白序列上进行以下3个方面的修饰突变：

（1）引入5个脯氨酸突变（V）。与SP-6相比，恢复986位置上天然Spike蛋白的赖氨酸，从而保留由K986介导的盐桥。

（2）在S1/S2 furin切割位点处引入一个短的，柔韧的，连接肽GGGSGGGS，以此来阻止S1丢失触发的S2融合后构象的转变。

（3）突变Y707C和T883C，在Spike单体的S2亚基和与其邻近的另外一个Spike单体的S2'之间引入二硫键，以此来维系Spike蛋白天然三聚体。

Erica Ollmann Saphire基于结构设计的Spike抗原—VFLIP。

回到这篇文章，他们以VFLIP Spike抗原作为骨架，在D614G原始Spike序列的基础上，同时引入5个来自Beta和Delta RBD 区域的突变，分别是K417N、L452R、T478K、E484K 以及N501Y，形成嵌合突变型Spike抗原，称为VFLIP-X。同时，研发人员还构建HexaPro-X Spike 抗原，也就是由6个脯氨酸突变+5个相同的来自Beta和Delta RBD 区域的突变组成，用来比较两种不同的抗原设计引起的Spike蛋白的表达差异。

研发人员把各种新冠变异株Spike序列和嵌合突变型Spike序列绘制系统发育树，结构发现嵌合突变型Spike序列在分支上更加接近Omicron-B.1.1.529 Spike序列。

VFLIP Spike抗原设计和HexaPro-X Spike 抗原设计以及Spike序列系统发育树比较。

CircRNA构建

在确定抗原序列后，采用我们前面介绍过的Daneil G.Aderson开发的Anabaena pre-tRNA I型内含子介导的环型RNA构建方法，构建CircRNA-VFLIP-X和CircRNA-HexaPro-X，转染HEK293T细胞，发现编码2种类型Spike蛋白的CircRNA在细胞内的表达水平是相似的。

WB和免疫荧光证实编码2种Spike抗原的CircRNA在HEK293T细胞中可以正常表达。

血清抗体反应

两款疫苗触发的血清抗体反应差异

用LNP(可电离脂质SM102)包封CircRNA-VFLIP-X和CircRNA-HexaPro-X，两针5ug免疫小鼠，间隔3周。ELISA数据显示两款疫苗触发相同水平的靶向Omircron-B.1.1.529 Spike 的血清结合抗体IgG。非常重要的是，假病毒中和试验显示，CircRNA-VFLIP-X疫苗可以触发高滴度的靶向Omicron-B.1.1.529的血清中和抗体，然而，CircRNA-HexaPro-X确无法触发靶向Omicron-B.1.1.529的血清中和抗体。

CircRNA-VFLIP-X和CircRNA-HexaPro-X疫苗两针免疫小鼠（5ug），触发相似水平的靶向Omicron-B.1.1.529 anti-Spike IgG血清结合抗体,而只有CircRNA-VFLIP-X疫苗才能触发高滴度的靶向Omicron-B.1.1.529的血清中和抗体。

CircRNA-VFLIP-X触发广谱型中和抗体

研究人员用CircRNA-VFLIP-X疫苗免疫小鼠，分为高剂量组5ug和低剂量组1ug，收集血清，测试血清靶向各种新冠变异株的血清中和抗体活性。结果发现，低剂量组1ug无法触发血清中和抗体，但是，高剂量组5ug可以触发高水平的靶向VOCs变异株的广谱型血清中和抗体。

活病毒和假病毒中和试验均显示CircRNA-VFLIP-X疫苗触发靶向各种新冠变异株的广谱型血清中和抗体。

CircRNA-VFLIP-X疫苗两针免疫小鼠，间隔3周，触发的靶向B.1.1.529的anti-Spike-IgG和血清中和抗体滴度随时间增加。

细胞免疫

在接种完第二针CircRNA-VFLIP-X疫苗后第七周，分离脾脏细胞，用B.1.1.529 -Spike多肽库刺激利用脾脏细胞，ELISpot分析细胞免疫反应。接种疫苗的小鼠脾脏细胞分泌高水平的IFN-γ，但是极低水平的IL-4。ELSIA数据显示，高剂量组5ug免疫小鼠，触发高水平的IgG2a和IgG1。以上数据说明，CircRNA-VFLIP-X疫苗偏向TH1细胞免疫反应。

TH1和TH2细胞免疫反应刺激B细胞分泌不同IgG亚型，两种类型的IgG抗体比例表征T细胞免疫反应的偏向性。

总结

（1）这项研究中设计的VFLIP-X Spike序列，在D614G原始Spike序列的基础，在RBD区域引入5个新冠VOCs突变，分别是K417N、L452R、T478K、E484K 以及N501Y。T478和E484位于Spike-RBM基序的峰顶区域（peak），K417 和L452位于Spike-RBM基序的峡谷区域（Valley），N501位于Spike-RBM基序的平顶区域（Mesa）。这些突变存在于Alpha/Beta/Delta会提升Spike和ACE2的结合亲和力，逃脱原始株触发的血清中和反应。这些5个突变位点的引入，使得CircRNA-VFLIP-X疫苗在面对VOCs具有非常广谱的中和能力。

（2）尽管CircRNA-HexaPro-X可以在细胞内正常表达，并且触发anti-Spike IgG血清结合抗体，但是无法触发靶向Omicron-B.1.1.529的血清中和抗体。在2021年， Danilo Casimiro发表文章：Immunogenicity and efficacy of mRNA COVID-19 vaccine MRT5500 in preclinical animal models，发现编码HexaPro 原始株 Spike 抗原的mRNA疫苗在恒河猴模型中也无法触发血清中和抗体。但是，中科大王育才团队开发的HexaPro Omicron Spike mRNA疫苗（S1/S2 furin切割位点未突变）和耶鲁医学院Sidi Chen采用的HexaPro Omicron Spike抗原+GSAS furin 切割位点突变 mRNA疫苗，均能够触发靶向Omicron-B.1.1.529的血清中和抗体。因此，这种HexaPro-Spike抗原设计对所触发血清中和抗体的影响，还需要未来更多的文章来进行探索。

（3）融合前构象可以触发强力中和抗体，已经被证实。值得注意的是，在S-2P/Hexa抗原设计中，RBD更多处于开放状态。然而还有些文章显示，RBD处于全部闭合状态的Spike抗原，例如VFLIP，要比S-2P/Hexa抗原触发更加强烈的中和抗体反应。而且，VFLIP要比Hexa抗原在糖基化位点分布上更加类似天然Spike。因此，在Spike抗原设计时，如何平衡RBD开放构象和闭合构象，融合前稳定状态和不稳定状态之间的关系是一个需要攻克的难题。