留胡子的豆腐

V1

2022/05/18阅读:22主题:红绯

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泰国玛希隆大学开发嵌合Spike环状新冠mRNA疫苗

2022年3月28号,泰国玛希隆大学Patompon Wongtrakoongate组在BioRxiv上传预印本文章:Broad neutralization of SARS-CoV-2 variants by circular mRNA producing VFLIP-X spike in mice,开发出一款广谱型的环状新冠mRNA疫苗,采用VFLIP Spike抗原设计,同时引入来自VOCs的6个突变,能够触发靶向各种VOCs的广谱型血清中和抗体和偏向TH1的细胞免疫反应。与目前广泛使用的S-2P Spike抗原相比,VFLIP Spike抗原拥有更加接近天然Spike的糖基化位点,更好的稳定性。在基于结构理性设计的抗原基础上,构建嵌合突变Spike,同时结合环形RNA平台,为迭代mRNA疫苗的开发提供非常好的思路。

抗原设计

在抗原设计上,研发人员采用Erica Ollmann Saphire基于结构设计的Spike抗原—VFLIP。与S-2P/S-6P相比,VFLIP不仅表达量和稳定性得以显著提升,更加重要的是同天然Spike具有相同的糖基化位点。VFLIP抗原,在Spike蛋白序列上进行以下3个方面的修饰突变:

(1)引入5个脯氨酸突变(V)。与SP-6相比,恢复986位置上天然Spike蛋白的赖氨酸,从而保留由K986介导的盐桥。

(2)在S1/S2 furin切割位点处引入一个短的,柔韧的,连接肽GGGSGGGS,以此来阻止S1丢失触发的S2融合后构象的转变。

(3)突变Y707C和T883C,在Spike单体的S2亚基和与其邻近的另外一个Spike单体的S2'之间引入二硫键,以此来维系Spike蛋白天然三聚体。

Erica Ollmann Saphire基于结构设计的Spike抗原—VFLIP。
Erica Ollmann Saphire基于结构设计的Spike抗原—VFLIP。

回到这篇文章,他们以VFLIP Spike抗原作为骨架,在D614G原始Spike序列的基础上,同时引入5个来自Beta和Delta RBD 区域的突变,分别是K417N、L452R、T478K、E484K 以及N501Y,形成嵌合突变型Spike抗原,称为VFLIP-X。同时,研发人员还构建HexaPro-X Spike 抗原,也就是由6个脯氨酸突变+5个相同的来自Beta和Delta RBD 区域的突变组成,用来比较两种不同的抗原设计引起的Spike蛋白的表达差异。

研发人员把各种新冠变异株Spike序列和嵌合突变型Spike序列绘制系统发育树,结构发现嵌合突变型Spike序列在分支上更加接近Omicron-B.1.1.529 Spike序列。

VFLIP Spike抗原设计和HexaPro-X Spike 抗原设计以及Spike序列系统发育树比较。
VFLIP Spike抗原设计和HexaPro-X Spike 抗原设计以及Spike序列系统发育树比较。

CircRNA构建

在确定抗原序列后,采用我们前面介绍过的Daneil G.Aderson开发的Anabaena pre-tRNA I型内含子介导的环型RNA构建方法,构建CircRNA-VFLIP-X和CircRNA-HexaPro-X,转染HEK293T细胞,发现编码2种类型Spike蛋白的CircRNA在细胞内的表达水平是相似的。

WB和免疫荧光证实编码2种Spike抗原的CircRNA在HEK293T细胞中可以正常表达。
WB和免疫荧光证实编码2种Spike抗原的CircRNA在HEK293T细胞中可以正常表达。

血清抗体反应

两款疫苗触发的血清抗体反应差异

用LNP(可电离脂质SM102)包封CircRNA-VFLIP-X和CircRNA-HexaPro-X,两针5ug免疫小鼠,间隔3周。ELISA数据显示两款疫苗触发相同水平的靶向Omircron-B.1.1.529 Spike 的血清结合抗体IgG。非常重要的是,假病毒中和试验显示,CircRNA-VFLIP-X疫苗可以触发高滴度的靶向Omicron-B.1.1.529的血清中和抗体,然而,CircRNA-HexaPro-X确无法触发靶向Omicron-B.1.1.529的血清中和抗体。

CircRNA-VFLIP-X和CircRNA-HexaPro-X疫苗两针免疫小鼠(5ug),触发相似水平的靶向Omicron-B.1.1.529 anti-Spike IgG血清结合抗体,而只有CircRNA-VFLIP-X疫苗才能触发高滴度的靶向Omicron-B.1.1.529的血清中和抗体。
CircRNA-VFLIP-X和CircRNA-HexaPro-X疫苗两针免疫小鼠(5ug),触发相似水平的靶向Omicron-B.1.1.529 anti-Spike IgG血清结合抗体,而只有CircRNA-VFLIP-X疫苗才能触发高滴度的靶向Omicron-B.1.1.529的血清中和抗体。

CircRNA-VFLIP-X触发广谱型中和抗体

研究人员用CircRNA-VFLIP-X疫苗免疫小鼠,分为高剂量组5ug和低剂量组1ug,收集血清,测试血清靶向各种新冠变异株的血清中和抗体活性。结果发现,低剂量组1ug无法触发血清中和抗体,但是,高剂量组5ug可以触发高水平的靶向VOCs变异株的广谱型血清中和抗体。

活病毒和假病毒中和试验均显示CircRNA-VFLIP-X疫苗触发靶向各种新冠变异株的广谱型血清中和抗体。
活病毒和假病毒中和试验均显示CircRNA-VFLIP-X疫苗触发靶向各种新冠变异株的广谱型血清中和抗体。
CircRNA-VFLIP-X疫苗两针免疫小鼠,间隔3周,触发的靶向B.1.1.529的anti-Spike-IgG和血清中和抗体滴度随时间增加。
CircRNA-VFLIP-X疫苗两针免疫小鼠,间隔3周,触发的靶向B.1.1.529的anti-Spike-IgG和血清中和抗体滴度随时间增加。

细胞免疫

在接种完第二针CircRNA-VFLIP-X疫苗后第七周,分离脾脏细胞,用B.1.1.529 -Spike多肽库刺激利用脾脏细胞,ELISpot分析细胞免疫反应。接种疫苗的小鼠脾脏细胞分泌高水平的IFN-γ,但是极低水平的IL-4。ELSIA数据显示,高剂量组5ug免疫小鼠,触发高水平的IgG2a和IgG1。以上数据说明,CircRNA-VFLIP-X疫苗偏向TH1细胞免疫反应。

TH1和TH2细胞免疫反应刺激B细胞分泌不同IgG亚型,两种类型的IgG抗体比例表征T细胞免疫反应的偏向性。
TH1和TH2细胞免疫反应刺激B细胞分泌不同IgG亚型,两种类型的IgG抗体比例表征T细胞免疫反应的偏向性。
CircRNA-VFLIP-X疫苗触发偏向TH1细胞免疫反应
CircRNA-VFLIP-X疫苗触发偏向TH1细胞免疫反应

总结

(1)这项研究中设计的VFLIP-X Spike序列,在D614G原始Spike序列的基础,在RBD区域引入5个新冠VOCs突变,分别是K417N、L452R、T478K、E484K 以及N501Y。T478和E484位于Spike-RBM基序的峰顶区域(peak),K417 和L452位于Spike-RBM基序的峡谷区域(Valley),N501位于Spike-RBM基序的平顶区域(Mesa)。这些突变存在于Alpha/Beta/Delta会提升Spike和ACE2的结合亲和力,逃脱原始株触发的血清中和反应。这些5个突变位点的引入,使得CircRNA-VFLIP-X疫苗在面对VOCs具有非常广谱的中和能力。

在一个RBD处于上行构象的三聚体Spike中,RBD区域出现的重要突变。
在一个RBD处于上行构象的三聚体Spike中,RBD区域出现的重要突变。

(2)尽管CircRNA-HexaPro-X可以在细胞内正常表达,并且触发anti-Spike IgG血清结合抗体,但是无法触发靶向Omicron-B.1.1.529的血清中和抗体。在2021年, Danilo Casimiro发表文章:Immunogenicity and efficacy of mRNA COVID-19 vaccine MRT5500 in preclinical animal models,发现编码HexaPro 原始株 Spike 抗原的mRNA疫苗在恒河猴模型中也无法触发血清中和抗体。但是,中科大王育才团队开发的HexaPro Omicron Spike mRNA疫苗(S1/S2 furin切割位点未突变)和耶鲁医学院Sidi Chen采用的HexaPro Omicron Spike抗原+GSAS furin 切割位点突变 mRNA疫苗,均能够触发靶向Omicron-B.1.1.529的血清中和抗体。因此 ,这种HexaPro-Spike抗原设计对所触发血清中和抗体的影响,还需要未来更多的文章来进行探索。

(3)融合前构象可以触发强力中和抗体,已经被证实。值得注意的是,在S-2P/Hexa抗原设计中,RBD更多处于开放状态。然而还有些文章显示,RBD处于全部闭合状态的Spike抗原,例如VFLIP,要比S-2P/Hexa抗原触发更加强烈的中和抗体反应。而且,VFLIP要比Hexa抗原在糖基化位点分布上更加类似天然Spike。因此,在Spike抗原设计时,如何平衡RBD开放构象和闭合构象,融合前稳定状态和不稳定状态之间的关系是一个需要攻克的难题。

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