留胡子的豆腐

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2022/03/12阅读:66主题:橙心

2022.3.12

新冠|不同突变株RBD mRNA疫苗在小鼠体内的免疫原性

自从2019年末,新冠疫情爆发以来,接种疫苗成为抗击疫情最主要的手段。在早期发现的VOC突变株中,面对康复病人的血清或者已经接种疫苗的人群,B.1.351 (Beta)突变株展现出最强的免疫逃脱能力。2020年12月出现B.1.617.2 (Delta)突变株,很快取代其他的VOC突变株,成为全世界范围内主要的新冠感染株。更加糟糕的是,Delta突变株基因组发生的突变,提升了病毒在人群中的传播能力,导致了更加严重的临床症状。去年11月在南非又出现B.1.1.529 (Omicron) 突变株,很快传播到全球。Omicron突变株基因组序列与先前发现的其他VOC突变株有很大的不同,S蛋白存在37个突变,RBD存在15个突变。这些突变导致Omicron突变株能够逃脱现存治疗性抗体的中和作用,减弱疫苗接种者体内产生的抗体的中和效应。尽管Omicron突变株感染人体后引发的症状比Delta突变株轻微,但是极强的传播能力必然会导致感染人群的激增,严重威胁整个社会的医疗系统。因此,面对不断涌现的新冠突变株,研发可以广泛防止VOCs突变株感染的疫苗是非常有必要的。

艾博文章显示接种原始ARCov-mRNA产生的抗体中和Omicron突变株能力发生极其显著的下降
艾博文章显示接种原始ARCov-mRNA产生的抗体中和Omicron突变株能力发生极其显著的下降

在2022年1月31号,台湾国立大学Mi-Hua Tao在bioRxiv上传文章Omicron-specific mRNA vaccine induced potent neutralizing antibody against Omicron but not other SARS-CoV-2 variants,这篇文章好玩的地方在于,比较新冠不同突变株RBD-LNP疫苗在小鼠体内触发机体免疫反应所产生的血清中和抗体在应对各种新冠突变株时的中和能力差异,为下一代新冠mRNA疫苗设计提供思路。

接下来,我们一起看看这篇文章如何设计各种不同的RBDmRNA疫苗以及免疫小鼠获得的免疫学试验数据。

编码新冠突变株RBD-mRNA疫苗序列设计

设计4种mRNA疫苗,分别编码野生型新冠病毒Spike蛋白RBD,Delta突变株Spike蛋白RBD,Omicron突变株Spike蛋白RBD,Delta-Omicron 杂交RBD(覆盖Delta和Omicron两者的突变位点)。

5'UTR

GGGAAAUAAGAGAGAAAAGAAGAGUAAGAAGAAAUAUAAGAGCCACC

Signal peptide

ATGGAGACAGACACACTCCTGCTATGGGTACTGCTGCTCTGGGTTCCAGGTTCCACCGGTGAC(来源于Igκ)

3'UTR

UGAUAAUAGGCUGGAGCCUCGGUGGCCAUGCUUCUUGCCCCUUGGGCCUCCCCCCAGCCCCUCCUCCCCUUCCUGCACCCGUACCCCCGUGGUCUUUGAAUAAAGUCUGA

质粒线性化酶切位点

EcoRV

加帽方式

采用共转录方式完成mRNA加帽,帽子类似物选择CleanCap AG,mRNA序列中的尿嘧啶全部用N1-methyl-pseudouridine替换掉。

编码不同突变株RBD mRNA疫苗序列设计
编码不同突变株RBD mRNA疫苗序列设计

测定编码新冠突变株RBD-mRNA转染细胞后的表达情况

体外转录完成以后,用安捷伦5200进行毛细管电泳分析,IVT反应产物mRNA的长度符合预期长度1000nt,纯度大概是93%。

安捷伦5200分析IVT合成的RBD-mRNA质量
安捷伦5200分析IVT合成的RBD-mRNA质量

把IVT反应产物转染293T细胞,收集上清,然后与能够稳定表达人ACE2的293T细胞共同孵育,最后用抗RBD的多克隆抗体检测结合到细胞表面的RBD,结果发现野生型WT-RBD mRNA,Delta-RBD mRNA,Omicron-RBD mRNA,Hybrid -RBD mRNA,均可以高效表达RBD。

流式细胞仪分析不同RBD-mRNA转染的细胞上清与表达人ACE2受体的细胞之间的结合情况
流式细胞仪分析不同RBD-mRNA转染的细胞上清与表达人ACE2受体的细胞之间的结合情况

LNP包裹新冠突变株RBD-mRNA

用LNP包裹T-RBD mRNA,Delta-RBD mRNA,Omicron-RBD mRNA,Hybrid -RBD mRNA制成RBD-LNP疫苗。此外,用LNP把Delta-RBD mRNA和micron-RBD mRNA按照1:1比例包裹制成二价RBD-LNP疫苗。然后转染细胞,收集上清,与能够稳定表达人ACE2的293T细胞共同孵育,利用流式细胞仪分析包裹在LNP内部的RBD在细胞内的表达情况。

用LNP制备5种不同的RBD-LNP疫苗,并且测试转染细胞后,RBD在细胞内的表达情况
用LNP制备5种不同的RBD-LNP疫苗,并且测试转染细胞后,RBD在细胞内的表达情况
Dynamic light scattering (DLS) 检测RBD-LNP疫苗的粒径大小,分散度以及Zeta电位
Dynamic light scattering (DLS) 检测RBD-LNP疫苗的粒径大小,分散度以及Zeta电位

不同RBD -LNP疫苗的免疫原性

接下来,利用小鼠模型,评价各种RBD-LNP 疫苗在小鼠体内触发的中和抗体反应。

接种方式

BALB/c mice分组接种2剂RBD-LNP 疫苗,间隔时间2周,肌肉注射,接种剂量 WT (10 μg per 229 dose), Delta (10 μg per dose), Omicron (10 μg per dose), Hybrid (10 μg per dose), and bivalent (5 μg of both Delta and Omicron RBD mRNA per dose)。

假病毒中和试验

收集免疫接种完成小鼠一周以后的血清,进行SARS-CoV-2 假病毒中和试验。结果显示:

(1)接种WT RBD疫苗的小鼠血清对于D614G,Beta,Delta新冠突变株的中和滴度NT50分别是6400,3000,4000。与此形成鲜明对比的是,接种WT RBD疫苗的小鼠血清对于Omicron突变株的中和能力发生显著下降,中和滴度NT50只有503。

(2)接种Omircon RBD疫苗的小鼠血清对Omicron突变株展示出极强的中和能力,中和滴度NT50高到18600,但是,诡异的是,对于其他类型的新冠突变株没有丝毫的中和能力。

(3)接种二价RBD疫苗(一半Delta RBD,一半Omircon RBD)的小鼠血清对于各种类型的病毒突变株展现出非常高的中和能力,对于D614G,Beta,Delta,Omicron突变株的NT50分别可以达到8600,1700,10500,4000。

(4)令人感到意外的是,接种Delta RBD疫苗的小鼠血清对于D614G,Beta,Delta,Omicron突变株也展示出非常高的中和能力,NT50居然可以达到11700,2200,17800,4000。

(5)接种Delta-Omicron 杂交RBD疫苗的小鼠血清对Omicron突变株展示出极高的中和能力,NT50高达21100,吊诡的是,对于其他类型的突变株显示出非常低的中和能力,对于对于D614G,Beta,Delta的NT50分别只有300,500,400。

总的来说,接种Omircon RBD疫苗的小鼠可以产生的抗体对于Omicron突变株有非常强的中和能力,但是对于其他类型的突变株丧失中和能力。接种二价RBD疫苗和Delta RBD疫苗的小鼠能够产生对于各种突变株有广泛中和能力的抗体。

比较新冠不同突变株RBD-LNP疫苗在小鼠体内触发机体免疫反应所产生的血清中和抗体在应对各种新冠突变株时的中和能力差异
比较新冠不同突变株RBD-LNP疫苗在小鼠体内触发机体免疫反应所产生的血清中和抗体在应对各种新冠突变株时的中和能力差异

总结

这篇文章最有意思的地方在于,发现接种Delta RBD疫苗的小鼠血清对于Omicron突变株也有很高的中和能力,在应对各种突变株的时候,可以提供交叉保护能力。接种Omicron RBD疫苗的小鼠血清尽管对Omicron突变株有极强的中和能力,但是非常不幸的是,对于其他类型的病毒突变株,完全丧失了中和能力,这说明Omicron Spike蛋白 RBD区域的许多突变诱导机体产生的抗体无法提供交叉保护能力。对于国内新冠mRNA疫苗研发公司来说,如何设计出对于各种新冠突变株具有广泛交叉保护能力的mRNA疫苗,是挑战,也是机遇。与其模仿,不如勇于尝试,设计出有自己特色的创新型mRNA疫苗。

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