留胡子的豆腐

V1

2022/05/06阅读:16主题:红绯

AAHI开发可室温稳定存放6个月的新冠自复制mRNA疫苗

AAHI开发可室温稳定存放6个月的新冠自复制mRNA疫苗

AAHI(Access to Advanced Health Institute)是一家座坐落于西雅图的非盈利性质的生物技术研究结构,致力于解决阻碍疫苗和免疫治疗发展的科学难题。2022年3月23号,AAHI合作者Corey Casper在BioRxiv上传文章:A self-amplifying RNA vaccine against COVID-19 with long-term room-temperature stability,他们开发出一款编码Spike 抗原的自复制新冠mRNA疫苗,利用可冻干且耐温的纳米结构脂质载体NLC(Nanostructured Lipid Carrier)包封samRNA-Spike(自复制mRNA)。在小鼠模型中,证实该款疫苗可以刺激机体产生强烈的体液免疫和细胞免疫。最大的特色是,用NLC包封samRNA可极大改善mRNA稳定性,使得samRNA疫苗在室温下(25°)存储长达6-8个月,依然具备良好的免疫原性,能够刺激产生高滴度的血清中和抗体。

今天,以这篇文章作为中心,我们展开来谈谈mRNA疫苗的稳定性,NLC递送系统以及采用LNC包封的saRNA疫苗的免疫效果。

mRNA疫苗的稳定性

mRNA分子天然不稳定

在存储上,mRNA疫苗相比于其他传统疫苗特殊之处在于,只要mRNA长链上任何一个地方发生变化,比如链断裂或者碱基氧化,就会导致翻译的终止,使其无法在细胞内表达出编码抗原。因此,检测mRNA分子完整性对于mRNA疫苗正常发挥功能来说是至关重要的。

mRNA分子天然不稳定,可以通过几种途径发生降解:

(1)物理不稳定性,加热变性(denaturation)会导致mRNA分子丢失二级或者三级结构。尽管二级或者三级结构对于mRNA分子活性的影响远远小于对于蛋白活性的影响。但是,在变性过程中,会发生聚集(aggregation)和沉淀(precipitation),对于mRNA分子正常翻译造成负面影响[2]。

(2)mRNA分子在体外主要通过水解发生化学降解。RNA分子核糖基团上面去质子化的2'OH会进攻磷酸基团,形成一个五元环的过渡状态。在这种过渡构象中,2'OH和磷酸基团以及即将离去的氧负离子处于同一条直线上。氧负离子离开,磷酸二酯键断裂,形成2',3'环磷酸酯,进一步水解形成2'-核苷酸和3'核苷酸。RNA分子被蛋白核酸酶,核酶以及酸碱降解的过程都是基于类似的水解过程[1]。

(3)此外,氧化会切割碱基,断裂单链,改变RNA二级结构,但是水解被认为是RNA分子降解的主要驱动力。

mRNA分子碱基的序列和二级结构会影响水解速率。碱基堆积(base-stacking)可能会减少磷酸二酯键切割速率。有些算法可以通过序列筛选最大化双链区域,缩小mRNA分子''平均未配对概率"(anverage unpaired probability)。CureVac通过提升mRNA分子中GC含量来改善mRNA稳定性,而Pfizer/Moderna在mRNA序列中加入修饰核苷酸-假基甲尿嘧啶,提升mRNA二级结构稳定性[2]。

RNA骨架磷酸二酯键的水解[1]
RNA骨架磷酸二酯键的水解[1]

LNP稳定性

除mRNA分子自身的稳定性,LNP的稳定性对于mRNA/LNP疫苗的质量控制也是非常关键的。mRNA分子会被普遍存在的核酸酶降解。由于mRNA分子的大小,携带负电荷,亲水性,使其无法轻易通过细胞膜。因此,需要用到递送系统来包封mRNA分子,使其可以稳定存在,免受外界降解因子的影响。目前主流的mRNA疫苗递送系统采用的是脂质纳米颗粒LNP递送系统,负电荷的mRNA分子被包封在多组分脂质系统里面。水合直径70-100nm RNA/LNP可以保护mRNA分子免受核酸酶降解,以内吞的方式成功进入到细胞内。

没用找到关于新冠mRNA疫苗LNP稳定性测试的数据,发现一款siRNA-LNP(Onpattro),其包封组分同mRNA-1273疫苗相似。当在2°-8°存贮时,这款siRNA-LNP可以安全存放3年。也就是说,决定mRNA疫苗稳定存储的限制因素是mRNA分子自身的不稳定性,而不是LNP的不稳定性[2]。

Moderna/Pfizer 新冠mRNA疫苗稳定性

mRNA稳定性会受到稳定,PH,离子强度,以及LNP组分的影响。我们可以看到Moderna新冠mRNA疫苗在冷藏条件(2°-8°)安全存放期限是1个月,而更新包封制剂后,Pfizer新冠mRNA疫苗在冷藏条件下,存放时间增加到两个多月。然而,这两款疫苗在室温下是不能存放的,开盖后,在2°-25°的温度下,必须在12h以内使用[3]。我们可以看到,RNA和LNP的稳定性依然是一个问题,当前授权的两款mRNA疫苗依然需要冷链运输以及严格的存放温度。

两款新冠mRNA疫苗存放和运输条件比较[3]
两款新冠mRNA疫苗存放和运输条件比较[3]

耐温的NLC递送系统

NLC系统代表一种水包油乳液(oil in water)和固相纳米颗粒的混合配方,曾经被开发出来用于亲脂性小分子药物的递送。纳米颗粒核心由液体油相,比如三十碳六烯(squalene)和固相脂质(三肉豆蔻酸甘油酯,Dynasan 114)构成。表面活性剂(Tween 80)和阳离子脂质(DOTAP)包围纳米颗粒核心。携带负电荷的RNA分子被阳离子脂质吸附在纳米颗粒表面。

2018年,Neal Van Hoeven在Molecular Therapy发表文章A Nanostructured Lipid Carrier for Delivery of a Replicating Viral RNA Provides Single, Low-Dose Protection against Zika,他们制备出一种寨卡病毒自复制mRNA疫苗,仅仅接种一针剂量时10ng的疫苗,就可以保护小鼠免于寨卡病毒感染造成的死亡。该疫苗采用高度稳定的纳米结构脂质载体NLC递送系统,并且与samRNA分开贮存,在接种前,可将samRNA和NLC递送系统即时混合,再进行注射。在这项研究中,我们可以看到NLC在25°存放9个月,其粒径大小依然保持不变,包封在颗粒表面的RNA会免于核酸酶的降解。

NLC递送系统成分,存放时间,以及保护RNA免于RNase降解
NLC递送系统成分,存放时间,以及保护RNA免于RNase降解

2022年3月14号,AAHI合作者Corey Casper在Molecular Therapy: Methods & Clinical Development发表文章,A flexible, thermostable nanostructured lipid carrier platform for RNA vaccine delivery Alana,他们发现液体NLC单独系统在冷藏温度(2-8°)可以存放1年,NLC/RNA冻干体系可以在室温下(25°)存放8个月,在冷藏温度存放21个月,耐温稳定的NLC系统可以极大拓宽mRNA疫苗的运输和存放条件。

NLC/RNA混合系统安全存放时间以及冻干样品
NLC/RNA混合系统安全存放时间以及冻干样品

saRNA/NLC 新冠疫苗

疫苗抗原设计

AAHI合作者Corey Casper设计的这款saRNA/NLC新冠疫苗选择编码的抗原是野生株Spike序列,将原始序列修改为Spike-D614G-2P-3Q,用Codex DNA进行密码子优化以适应人细胞高效表达。

(1)加入D614G突变

(2)将Spike蛋白序列987-988位置处的KV替换为PP

(3)将Spike蛋白序列683-686位置处的RRAR替换为QQAQ,突变S1/S2 furin切割位点。

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疫苗触发的血清中和抗体反应

saRNA/NLC新冠疫苗(AHHI-SC2)免疫小鼠,可以强烈触发anti-Spike IgG血清结合抗体和靶向不同VOCs血清中和抗体,并且存在剂量依赖效应。即刻在1ug剂量的情况,AHHI-SC2疫苗也可以触发高滴度的anti-Spike IgG血清结合抗体。与靶向野生株/Alphfa的血清中和抗体滴度相比,靶向Beta/Delta变异株的血清中和抗体滴度明显发生下降,但是同对照组相比,依然维系在一个较高的水平。此外,还可以检测到大量骨髓驻留细胞分泌IgA和IgG,这表明疫苗建立起长效分泌IgG的浆细胞群体,并且可以触发粘膜免疫。

AHHI-SC2免疫小鼠强烈触发血清抗体反应
AHHI-SC2免疫小鼠强烈触发血清抗体反应

疫苗触发的细胞免疫

AAHI-SC2第一针免疫小鼠,分离其肝脏细胞,用SARS-CoV-2重叠肽去刺激肝脏细胞,可以诱导产生大量分泌IFN-γ的肝脏细胞,而基本上检测不到分泌IL-5/IL-17A的Th2型肝脏细胞。AAHI-SC2可以强烈刺激产生Th1型CD4+细胞和CD8+细胞,并且存在非常明显的剂量依赖效应,同时第二针加强免疫后,又可以获得数倍提升。

AHHI-SC2免疫小鼠强烈触发偏向Th1的细胞免疫反应
AHHI-SC2免疫小鼠强烈触发偏向Th1的细胞免疫反应

saRNA/NLC 疫苗冻干处理

液体型AAHI-SC2疫苗稳定性

对于短期存放,研发人员将AAHI-SC2新冠疫苗存放在20%蔗糖+5mM柠檬酸钠溶液中,存放两周以后,发现在所有测试温度下(-80°-40°),saRNA/NLC包封水合直径均未发生变化。然后,将不同温度下存放的疫苗,免疫小鼠,结果发现在25°下存放的疫苗触发的血清抗体滴度开始下降,而在40°条件下存放的疫苗,完全丧失免疫原性,无法刺激小鼠产生抗体。

在不同温度下存放2周以后,AAHI-SC2液体型疫苗免稳定性变化
在不同温度下存放2周以后,AAHI-SC2液体型疫苗免稳定性变化

冻干型AAHI-SC2疫苗稳定性

为实现疫苗长期存储,研发人员将AAHI-SC2进行冻干处理,比较不同温度下,不同冻干辅料配方,存储前后稳定性和免疫原性变化,结果发现20%蔗糖+5mM柠檬酸钠为最佳的冻干辅料配方。采用该冻干辅料将AAHI-SC2疫苗进行冻干处理,室温存放6个月后,免疫小鼠,尽管测定的anti-Spike血清结合抗体滴度同冷藏温度下存放的疫苗相比有所下降,但是假病毒中和试验测定的血清中和抗体滴度同新鲜配置的,冻存-80度,冻干存放在4°的维持在同一水平。这表明saRNA/NLC疫苗冻干处理后,在冷藏环境下,甚至是室温环境下,可以长期温度存放多达六个月,不会对其免疫原性造成损害。

AAHI-SC2冻干型疫苗在不同温度下存贮数月后的稳定性变化
AAHI-SC2冻干型疫苗在不同温度下存贮数月后的稳定性变化

比较不同mRNA疫苗存储时间

为解决mRNA疫苗对于存放温度的苛刻要求,研发人员一直在探索能够提升mRNA疫苗稳定性,可供室温长期存放的方法:

(1)艾博通过存放在不同温度下的FLuc-LNP mRNA在小鼠体内的表达来评估其开发的ARCov mRNA-LNP 液体型疫苗稳定性,结果发现FLuc-LNP mRNA可以在室温下存放7天后,注射到小鼠体内,mRNA表达水平基本不会发生改变。

(2)在2022年5月4号,NorbertPardi在Molcular Therapy发表文章:Lyophilization provides long-term stability for a lipid nanoparticle-formulated, nucleoside-modified mRNA vaccine,他们开发的冻干型mRNA-LNP流感病毒疫苗可以在室温下存放12周,依然保持其正常的免疫原性。

(3)在2022年2月11号,国内瑞科基生物与合作者蓝柯在BioRxiv上提交文章:Lyophilized mRNA-lipid nanoparticle vaccines with long-term stability and high antigenicity against SARS-CoV-2,开发出可以在室温下长期稳定存放的mRNA-LNP 新冠mRNA疫苗,但是,该项工作只是通过测定不同温度下,在不同时间点,纳米颗粒的直径,包封效率,mRNA降解情况来间接推断,在文章中并未找到直接比较不同温度下存放不同时间的mRNA-LNP在体内的表达效果和免疫原性变化。

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总结

AAHI开发的AAHI-SC2新冠疫苗,这款疫苗采用saRNA/NLC系统,在室温下可以放置长达6个月,依然保持其正常的免疫原性,远远超过此前相关的研究数据,同时能够提供非常卓越的保护能力,避免mRNA被RNAase降解。更加重要的是,相比于LNP递送系统,NLC系统不需要特殊设计的,具有专利保护的可电离脂质,而是用到商业化的非常容易获得的DOTAP,因此制备简单,产量放大迅速。此外,NLC系统是独立制备的,可以大量贮存,能够与不同长度的RNA即时混合接种,这样在面对不断涌现的变异株时,将会大大加快疫苗研发的速度。


1.Theoretical basis for stabilizing messenger RNA through secondary structure design

2.mRNA-lipid nanoparticle COVID-19 vaccines: Structure and stability

3.Stability Modelling of mRNA Vaccine Quality Based on Temperature Monitoring throughout the Distribution Chain

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