墨滴

锹形虫

V1

2022/09/24阅读：19主题：嫩青

实验Roll220924

一些实验笔记，请随意浏览

蛋白质的提取（细胞）

1. 准备工作：

离心机4°C预冷、打冰盒、无菌无酶的枪头和EP管（2套）（做标记：细胞系+组别+日期+名字）

2. 配置细胞裂解液

RIPA：Cocktail = 100:1（比使用量多配一点）
	RIPA：4°C
	cocktail：（-20°C，倒2层、20微升分装、常温解冻；400微升——600微升）（多配）

3. 细胞收样

*每孔换抢头，弃培养液
4°C，冷PBS洗两遍——丢弃PBS（吸干净，防止影响后续浓度）——每孔加100微升裂解液
————摇床25min，转速125（常温，冰上裂解），都在冰上操作
————用1ml枪头平的那面刮下细胞（手不要碰到枪头上端）
————吹打混匀移入EP管
————摇床5min————离心4°C，14000转，15min————取上清液（100微升取80微升）至新EP管

4. 测浓度（BCA法）

酶标仪的使用

  1. 先刷卡上机，先开电脑，后开酶标仪
  2. Tecan[control] 软件； 1g微升的生理盐水+1微升的蛋白液+200微升（A+B） 30min
    1. 选“COS96ft-Costar 96 Flat Transparent” - Plate definition
  3. Absorbance 吸光度
    1. BCA ：562 nm 、CCK8： 450 nm 、MTT：490nm
  4. 选孔：
    1. [ ]勾选multiple teads per well（多次测量） 2.type： square、 Size：4x4 、broaden：750nm
  5. measure
  6. 数据处理 ？
  7. 上传数据
  8. “先是后否”，关酶标仪，刷卡下机

杀鼠取肺

https://v.qq.com/x/page/m0882clb89k.html

细胞的质粒转染

一、实验目的

  1. 学习细胞转染技术
  2. 将基因操作之后的质粒或者siRNA转移到细胞中并表达

二、实验器材

  1. 赛默飞Lipofectamine 2000 转染试剂———用于转染SiRNA
  2. FuGENE® 6 DNA———用于转染质粒
  3. 培养基：Opti-MEM｜减血清培养基———可以不添加血清即可提供细胞生长贴壁所需材料；而血清会影响转染的效率
  4. 6孔板

三、实验步骤

  1. 铺板：24h后，细胞长到50%-60%左右转染

  2. 用于一行提取RNA、一行提取蛋白质（纵标目：PcDNA、casP8；2x2）

  3. 准备2倍的1.5ml五菌无酶的EP管（在塑料袋内合上盖子再拿到操作台）（2x4，第一行+质粒、第二行+FuGENE）

    pcDNA casP8(WT) For
    o o extract RNA
    o o extract PR

2倍的意思是，下面的操作一半的EP管是加的质粒+Opti，一半加的是FuGENE+Opti

ep1 ep 2 ep3 ep4
Opti+质粒 o o o o
Opti+FuGENE o o o o

  1. 先都加入250µl的Opti-MEM

  2. 计算质粒要加的量为：3000/a µl ； 常规3µg（3000ng）测的浓度a ng/µl

  3. FuGENE：质粒 = 3 ： 1 ；一般就是9µl的FuGENE，因为其浓度为1µg/µl

  4. 反应5min

  5. 对应混合（FuGENE+Opti）与（质粒+Opti）的EP管，反应20min（该步骤完成了带有质粒及转染能力的混合液的配置）

  6. 细胞标好组之后，用PBS洗一遍，自孔加入1.5ml的Opti-MEM，然后再加入上述混合液

  7. 6-8h后换成全血清培养基

  8. 收样

    1. PBS洗2遍，胰美加入后很快吸出，反应1-2min，加入培养基，吹打混匀形成细胞悬液
    2. 细胞计数（MTT）的基线一致，一板2测取均值

细胞的培养基配置，细胞传代、铺板、冻存、复苏

一、 实验目的

  1. 学一些细胞的基本操作

二、 实验原理

～

三、 实验器材

  1. 培养基的配置
    1. 1640培养基、 DMEM培养基（高糖）、不完全培养基、小牛血清（FBS）、双抗(青霉素-链霉素混合液)

  2. 细胞的传代

  3. 细胞的铺板

  4. 细胞的冻存
    1. 冻存混合液（血清：DMSO = 9:1）
    2. 含需要冻存细胞的培养皿
    3. 胰酶液（消化）
    4. 15ml离心管、离心机、PBS缓冲液

  5. 细胞的复苏

四、 实验步骤

1. 培养基的配置

  1. A549细胞使用1640培养基；SP细胞使用DMEM培养基（高糖）
    1. 含有血清的为完全培养基、不含血清的是不完全培养基
    2. 500ml不完全培养基——>（-50ml）——>450ml+50ml小牛血清FBS+5ml双抗（1%））———>即得到完全培养基； 双抗在常温解冻，血清可以放在水浴锅中解冻
    3. 5ml完全培养基+45ml不完全培养基——>得到低营养培养基；

2. 细胞的传代

3. 细胞的铺板

4. 细胞的冻存

  1. 冻存混合液的配置：血清：DMSO=9:1 配置。1皿细胞冻存2管，每管+1ml冻存液，+2ml重悬细胞液
  2. 将皿中细胞使用胰酶消化，移至15ml离心管中，离心（800rpm，4min），丢弃上清液
  3. 使用PBS缓冲液重悬细胞，再次离心（清洗作用），丢弃上清液，使用冻存液重悬细胞
  4. 将细胞冻存

5. 细胞的复苏

细胞铺设（表型）&克隆及生长曲线测定制作

一、 实验目的

  1. 将转染后的细胞铺设至96孔板中，用于后续5天的检测
  2. 学习细胞表型铺设已经生长数据，生长曲线的制作

二、实验原理

  1. 细胞铺设仅是操作，提供细胞特定生长环境并储存
  2. 生长情况测定使用的是MTT法，即在培养基上使用MTT浸染孵育之后，细胞代谢过程会存在MTT内容物并生成蓝紫色结晶，而二甲亚砜可以将这种结晶溶解，并在震荡后混色均匀，用于吸光度的测定以反映细胞生长情况（活细胞） MTT法是一种检测细胞存活和生长的方法。MTT为黄色化合物,是一种接受氢离子的染料,可作用于活细胞线粒体中的呼吸链,在琥珀酸脱氢酶和细胞色素C的作用下,外源性MT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒( Formazan)并沉积在细胞中,而死细胞无此功能。二甲基亚砜(DMSO)能溶解细胞中的甲瓒,用酶联免疫检测仪在490nm波长处测定其光吸收值,可间接反映活细胞数量。在一定细胞数范围内,MT结晶形成的量与活细胞数成正比 [1]  。

三、 实验器材

获得转染后24h的细胞可以铺设表型

  1. 转染后24h的细胞培养基、96孔板（生长曲线）、6孔板（细胞克隆）、无菌枪头、EP管、10ml无菌管
  2. 低营养培养液（低培）、胰酶液（用于使贴壁细胞脱落，隔断细胞间连接）、全营养培养液

四、 实验步骤

提前写好平板编号，对应孔数的EP管，10ml管

  1. 用胰酶液消化细胞。用1ml低营养培养液（5ml全营养培养液+45ml双无培养液）重悬细胞。转染之后的不同组别需要更换抢头

  2. 细胞计数（大概在镜下查看各组细胞量的多少），+10µl计数板上计数

  3. 计算+悬液量

    names density volume of cell suspension volume of complete nutrient medium(CNM)
    NC/VECT a 800/a 1000-800/a
    1# b 800/b 1000-800/b
    ...

    已计算得到：800/a意味着，当加入800/a µl的 a 浓度的细胞悬液的时候，其包含了80000个细胞在内，1000- 800/a 是使用全营养培养液补齐1000µl

  4. 10ml管一起配置，先加入7ml的全营养培养液，然后加入1000-800/a 的全营养培养液，然后加入800/a的细胞悬液，震荡摇匀。

    1. 测生长曲线的96孔板，按照组别每孔+20µl ；五块板，观测五天
    2. 制作细胞克隆的6孔板，先摇晃混匀之后，每孔+100µl细胞悬液，+2ml全营养培养液； 第五天需要更换营养液（已贴壁，直接更换），2-3天即可收样使用，此步完成细胞的克隆

  5. 测定细胞生长曲线

    1. 配置MTT溶液：
      1. 5mg/ml ，使用PBS缓冲液配制：0.25g MTT粉末+50ml PBS
      2. 裹上锡纸避光，封上封口膜，在37°C水浴锅中溶解完全
      3. 过滤：使用50ml针筒，在过滤器中过滤。使用完毕的针头需要用离心管封装后丢弃
      4. 4°C保存MTT溶液
    2. 测定生长曲线数据
      1. 上述配置的96孔板，每孔+20µl MTT溶液，于细胞箱中孵育4h，丢弃培养液。
      2. 每孔+150µl的DMSO（二甲亚砜），震荡10min，使结晶物质充分溶解
      3. 在490nm下测定96孔板吸光度

RNA的提取纯化&逆转录&荧光定量分析

一、实验目的

  1. 学习RNA的提取纯化
  2. 学习RNA的逆转录
  3. 学习RNA的荧光定量分析

二、 实验原理

1. Trizol溶液（RNA抽提剂）：

可提取总RNA，迅速破碎细胞并抑制细胞释放出的核酸酶。
苯酚、异硫氰酸胍
苯酚（主要）：裂解细胞、使蛋白，核酸等物质得到解聚和释放
异硫氰酸胍：抑制内外RNAse（RNA酶）的活性

2. 氯仿（使溶液分相）

三氯甲烷，使溶液分层为水相和有机相，在酸性环境下，RNA更易溶于水相，而pr和DNA更易溶于有机相

3. 异丙醇（使水相中RNA沉淀）：

异丙醇类似于乙醇，含有-OH，对水的亲和力很高，因此在异丙醇溶液中，RNA周围的水会被夺走，从而沉淀

4. DEPC水（无RNAse水）

用RNA酶抑制剂处理过后的水，可以使获得的RNA溶液中的RNAse灭活

5. 测定纯化之后RNA的浓度并配置逆转录体系

根据浓度计算RNA的量，从而确定所需要配成的20微升的体系中另外两种试剂的量
另外两种试剂：DEPC水（补足20微升用）、商用RNA逆转录mix试剂（4微升）
因此RNA的量改变的是加入DEPC水的量

体系配制完成，到逆转录机器（PCR？）中完成逆转录，形成cDNA（complimentary DNA；互补DNA）；cDNA将比RNA更加稳定，则无须再继续在冰上操作，无低温要求。 但需要注意的是，cDNA仍然是一条单链，只不过其内容是DNA序列。

这里存在的问题1是：在逆转录为cDNA的时候，原来的RNA单链是否会被RNA水解掉，从而在完成逆转录之后，仅会得到cDNA 问题2是：逆转录为cDNA的时候，是否一条RNA链只会被逆转录一次？如果被RNA酶水解之后，还会被再次逆转录吗？

回答：如果温度可以控制反应过程，那么在形成RNA-cDNA的温度下，这个双链并不会解开，而此温度下，RNA也不会产生效果。当温度随程序改变，这个双链解开，RNA酶也到了工作温度开始发挥作用，而此时则离开了逆转录酶的工作温度，因此仅会谁接RNA，而不会再次发生逆转录过程。

6. 实时荧光定量分析

7. 利用cDNA配制新的，实时荧光定量分析机器所需的体系

原理为，得到的cDNA仅是与纯化RNA互补的序列，它仅是一条单链。且它的量与RNA的量是对等的。因此如果我们需要对原来的RNA序列进行定量分析，就可以利用CT（循环阈值）的概念对其进行扩增，根据其CT值定量获得其由cDNA反映的RNA的量。则，此阶段的原理就是对cDNA进行荧光标记并扩增，得到其循环阈值从而获得我们原本的RNA的量（浓度）的多少

8. cDNA扩增原理

cDNA可以直接作为模板形成第二条链，则两条链形成双螺旋的完整DNA链。并以此链在合适的条件下进一步扩增；
上游引物、下游引物？

9. 荧光标记

TB-green试剂：详见其说明书，用于实时荧光PCR的试剂

三、 实验器材

  1. 无菌无酶枪头、EP管、PBS缓冲液、细胞已贴壁的培养基
  2. Trizol试剂———从组织和细胞中分离总 RNA，包括富含脂肪组织和难提取样品
  3. 氯仿———使溶液分相
  4. 异丙醇———使水相中的RNA沉淀
  5. DEPC水———无RNAse水
  6. 逆转录管、滤纸、冰盒、4°C离心机预冷

四、 实验步骤

  1. 收样 无菌无酶枪头，EP管
    1. 吸掉培养基、冷的PBS洗两遍
    2. 加入500µl的Trizol，静置3-5min
    3. 吹打混匀，转移到EP管；（如果暂时不需要提取，则可冷冻倒-80°C保存）
  2. 提取RNA

4°C离心机预冷、异丙醇预冷、一套无菌无酶的枪头，对应数量的无菌无酶的1.5ml的EP管。额外+1个EP管放DEPC水（N+1）、对应数量的逆转录管、滤纸、冰盒

1. 每管（6孔板的1/2孔收的样）加100µl（200µl氯仿）*可将氯仿先倒至50ml管中备用*
2. 上下颠倒（混合充分）10次+，冰上静置2-3min，离心（12000rpm，15min，4°C）*在等待离心时可以先给一套新的EP管编号、配置75%的乙醇预冷*
3. 取上清液，200µl
4. 1：1加入异丙醇（200µl），上下颠倒10次+，冰上静置10min，离心（1200rcf（g），10min）
5. 倒掉液体，倒扣在滤纸上吸水
6. 加入已预冷的1ml 75%乙醇，离心（7500 rcf（g），5min）
7. 倒掉，倒扣在滤纸上吸水，空转离心（5000 rpm，3min）
8. 用20µl枪头吸1-2次，吸干管中液体（在沉淀的对侧吸取），晾干1-2min
9. 加入20µl的DEPC水溶解；（浓度高时可多加10µl）
10. 测浓度，获得浓度a
  1. 逆转录 配置逆转录所需的体系
    1. 体系总成20µl：（MIX试剂+RNA+RNAse水）
      1. MIX固定4µl
      2. RNA的量为1000/a
      3. 配套水的量为：16-1000/a （补齐作用）
    2. 剩余RNA存至 -80°C备用
    3. 使用红色的PCR仪进行逆转录：“ZC”——“15min...”——使用已预设的模式完成

逆转录之后，我们的RNA将会被降解，而得到与原来RNA的量相等且序列配对的cDNA。该cDNA将会在荧光定量PCR中进行扩增，而根据其扩增情况得到的CT（循环阈值）即可判断该cDNA的含量，即反映了原本对应的不同RNA的不同含量

  1. 实时荧光定量PCR 配置实时荧光定量PCR所需的体系

    1. 体系总成：10µl：（cDNA + TBGreen + ddH2O（高压无菌水） + Rox +F（引物） + R（引物））
      1. cDNA固定1µl
      2. TBgreen固定5µl
      3. ddH2O固定3.4µl
      4. Rox：0.2µl
      5. F：0.2µl
      6. R ：0.2µl

    因为除cDNA外其他9µl的内容都是一样的，因此可先配置后续的9µl，并添加到多孔板中

    1. 版面设置：

      PcDNA CasP8 Tips
      GAPDH ooo(Three wells) ooo 1份内参体系，各自+cDNA
      Target GENE ooo ooo 1份目的基因体系，各自+cDNA

    2. 上机进行实时荧光定量PCR

      1. 上机、QuantStudio tm Real-Time PCR Software
      2. new Experiment
      3. which block are you use to run the experiment? ---384-well
      4. which reagents do you want to use to detect the target sequence?---SYBR Green Reagents
      5. what properties do you want for the instument run?---standard
      6. Assign 选孔（control点选），Targets [√]，sample[√]
      7. Run method : Reaction Volume per well : 10 µl
      8. Run ---start Run ---选择文件保存位置---“Yes”

    3. 下机要求

      1. 右上角"Analysis"进度条完成
      2. 左下"Export" ---"Results" --- "well position" "CT"
      3. Export File Location 改路径
      4. Save 整个程序
      5. Export
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