实验ROLL221004

蛋白质的提取（细胞）

一、 准备工作：

离心机4°C预冷、打冰盒、无菌无酶的枪头和EP管（微型离心管）（2套）（做标记：细胞系+组别+日期+名字）

二、 配置细胞裂解液

RIPA：Cocktail = 100:1（比使用量多配一点）
	RIPA：4°C
	cocktail：（-20°C，倒2层、20微升分装、常温解冻；400微升——600微升）（多配）

三、 细胞收样

*每孔换抢头，弃培养液
4°C，冷PBS洗两遍——丢弃PBS（吸干净，防止影响后续浓度）——每孔加100微升裂解液
————摇床25min，转速125（常温，冰上裂解），都在冰上操作
————用1ml枪头平的那面刮下细胞（手不要碰到枪头上端）
————吹打混匀移入EP管
————摇床5min————离心4°C，14000转，15min————取上清液（100微升取80微升）至新EP管

四、 测浓度（BCA法）

酶标仪的使用

1. 先刷卡上机，先开电脑，后开酶标仪
2. Tecan[control] 软件 1g微升的生理盐水+1微升的蛋白液+200微升（A+B） 30min

   1. 选“COS96ft-Costar 96 Flat Transparent” - Plate definition
3. Absorbance 吸光度

   1. BCA ：562 nm 、CCK8： 450 nm 、MTT：490nm
4. 选孔：

   1. [ ]勾选multiple teads per well（多次测量） 2.type： square、 Size：4x4 、broaden：750nm
5. measure
6. 数据处理 ？
7. 上传数据
8. “先是后否”，关酶标仪，刷卡下机

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细胞的质粒转染

一、实验目的

1. 学习细胞转染技术
2. 将基因操作之后的质粒或者siRNA转移到细胞中，干扰特定mRNA的表达

二、实验器材

1. 赛默飞Lipofectamine 2000 转染试剂———用于转染SiRNA
2. FuGENE® 6 DNA———用于转染质粒
3. 培养基：Opti-MEM｜减血清培养基———可以不添加血清即可提供细胞生长贴壁所需材料；而血清会影响转染的效率（血清中可能含有RNase）
4. 6孔板

三、实验步骤

1. 铺板：24h后，细胞长到50%-60%左右转染

2. 用于一行提取RNA、一行提取蛋白质（纵标目：PcDNA、casP8；2x2）

3. 准备2倍的1.5ml五菌无酶的EP管（在塑料袋内合上盖子再拿到操作台）（2x4，第一行+质粒、第二行+FuGENE）

   pcDNA	casP8(WT)	For
   o	o	extract RNA
   o	o	extract PR
   2倍的意思是，下面的操作一半的EP管是加的质粒+Opti，一半加的是FuGENE+Opti

   	ep1	ep 2	ep3	ep4
   Opti+质粒	o	o	o	o
   Opti+FuGENE	o	o	o	o

   2. 先都加入250µl的Opti-MEM
   3. 计算质粒要加的量为：3000/a µl ；常规3µg（3000ng）测的浓度a ng/µl
   4. FuGENE：质粒 = 3 ： 1 ；一般就是9µl的FuGENE，因为其浓度为1µg/µl
   5. 反应5min
   6. 对应混合（FuGENE+Opti）与（质粒+Opti）的EP管，反应20min（该步骤完成了带有质粒及转染能力的混合液的配置）
   7. 细胞标好组之后，用PBS洗一遍，自孔加入1.5ml的Opti-MEM，然后再加入上述混合液

4. 6-8h后换成全血清培养基

5. 收样

   1. PBS洗2遍，胰美加入后很快吸出，反应1-2min，加入培养基，吹打混匀形成细胞悬液
   2. 细胞计数（MTT）的基线一致，一板2测取均值

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细胞的培养基配置，细胞传代、铺板、冻存、复苏、换液

一、 实验目的

1. 学一些细胞的基本操作

二、 实验原理

1. 细胞在适合的环境下持续的无丝分裂增殖，在一定的分裂次数内可以获得大量细胞
2. 增殖过程中因为细胞自身特性，其会在处理过的核实培养基的底部贴壁生长，而贴壁生长的细胞并不容易被液体冲洗脱落

三、 实验器材

1. 培养基的配置

   1. 1640培养基、 DMEM培养基（高糖）、不完全培养基、小牛血清（FBS）、双抗(青霉素-链霉素混合液)
2. 细胞的传代

   1. 1ml移液枪、枪头、超净工作台、培养皿、50ml离心管
   2. 汇合度达到80%以上的细胞培养皿、移液枪、胰酶消化液、合适的培养基（FBS）、PBS缓冲液
3. 细胞的铺板

   1. 1ml移液枪、枪头、超净工作台、培养皿、15ml离心管、六孔板（or多孔板）
   2. 汇合度达到80%以上的细胞培养皿、移液枪、胰酶消化液、合适的培养基（FBS）、PBS缓冲液
4. 细胞的冻存

   1. 冻存混合液（血清：DMSO = 9:1）
   2. 含需要冻存细胞的培养皿
   3. 胰酶液（消化）
   4. 15ml离心管、离心机、PBS缓冲液
5. 细胞的复苏

   1. 冻存细胞管（半管？全管？）（-80°C冰箱）
   2. 水浴锅、枪头、移液枪、培养皿（大皿）、50ml管（用于分装培养基）、15ml管
   3. 全血清培养基
6. 细胞的换液

   1. 需要换液的细胞（皿）
   2. 移液枪、枪头、对应培养基、超净工作台

四、 实验步骤

1. 培养基的配置

1. A549细胞使用1640培养基；SP细胞使用DMEM培养基（高糖）

   1. 含有血清的为完全培养基、不含血清的是不完全培养基
   2. 500ml不完全培养基——>（-50ml）——>450ml+50ml小牛血清FBS+5ml双抗（1%））———>即得到完全培养基；双抗在常温解冻，血清可以放在水浴锅中解冻
   3. 5ml完全培养基+45ml不完全培养基——>得到低营养培养基；

2. 细胞的传代

1. 将达到要求汇合度的细胞培养皿取出，在镜下观察其生长状态，移至超净工作台

   1. 吸净皿中残余培养基，加入适量PBS清洗培养皿，然后加入1ml～2ml胰酶消化液消化贴壁细胞（将胰酶消化液漫过培养基底部，保证所有细胞都接触到，晃动几次后洗净消化液避免消化过度），等待大约5min完成消化（常温）（细胞培养箱中约2min）
   2. 消化完成的细胞使用2ml培养基重悬所有细胞，保证所有细胞都被重悬至15ml离心管中，加入培养基10ml左右配置12ml+细胞悬液（需要有余裕量），然后在涡旋器上振摇至细胞混合均匀，迅速使用移液枪吸取10微升细胞悬液（离心管液中部吸取）加入细胞计数板中，插入计数器计数，获得细胞浓度
   3. 将细胞悬液涡旋后均匀分配至两个培养皿中，使用心的培养基配平至适宜的液体体积（此可以根据细胞浓度以及皿的底面积大小计算获得最佳培养基量）
   4. 移动完成中使用十字摇动使细胞在皿中均匀分布，平稳移至细胞培养箱中

3. 细胞的铺板

1. 将达到要求汇合度的细胞培养皿取出，在镜下观察其生长状态，移至超净工作台

   1. 吸净皿中残余培养基，加入适量PBS清洗培养皿，然后加入1ml～2ml胰酶消化液消化贴壁细胞（将胰酶消化液漫过培养基底部，保证所有细胞都接触到，晃动几次后洗净消化液避免消化过度），等待大约5min完成消化（常温）（细胞培养箱中约2min）
   2. 消化完成的细胞使用2ml培养基重悬所有细胞，保证所有细胞都被重悬至15ml离心管中，加入培养基10ml左右配置12ml+细胞悬液（需要有余裕量），然后在涡旋器上振摇至细胞混合均匀，迅速使用移液枪吸取10微升细胞悬液（离心管液中部吸取）加入细胞计数板中，插入计数器计数，获得细胞浓度
   3. 根据细胞浓度计算大约每孔10w个细胞（或粗略计算为2ml细胞悬液），再次涡旋细胞悬液后定量移至六孔板中，将剩余细胞悬液移入新的培养皿中，加入适量培养基继续培养。
   4. 在移动细胞悬液之后需要使用十字摇动使细胞在皿或者六孔板中均匀分布，可在之后的镜下观察细胞聚集状态从而获得其平铺均匀情况

4. 细胞的冻存

1. 冻存混合液的配置：血清：DMSO=9:1 配置。1皿细胞冻存2管，每管+1ml冻存液，+2ml重悬细胞液
2. 将皿中细胞使用胰酶消化，移至15ml离心管中，离心（800rpm，4min），丢弃上清液
3. 使用PBS缓冲液重悬细胞，再次离心（清洗作用），丢弃上清液，使用冻存液重悬细胞
4. 将细胞冻存（-80°C）

5. 细胞的复苏

1. 水浴锅预热到37°C，并将培养基水浴到37°C
2. 将细胞冻存管取出，在水浴锅中快速融化，移至15ml管中，+2ml培养基，吹打混匀
3. 将15ml管离心（800rpm、4min）
4. 离心完毕弃去上清液、吸净残留、+2ml培养基重悬（吹打混匀）
5. 在大皿中，先加入6ml培养基，再将细胞悬液移至大皿，铺满皿底，十字摇动使细胞平铺均匀
6. 平稳转移至细胞培养箱，第二天同时间换液。

6. 细胞的换液

1. 镜下查看细胞生长情况
2. 将细胞箱中的细胞皿取出，将培养基取出置于超净工作台上
3. 讲原皿中的培养基吸净弃去，吸入9ml新的培养基
4. 放回细胞箱

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细胞铺设（表型）

一、 实验目的

1. 将转染后的细胞铺设至96孔板中，用于后续5天的检测
2. 学习细胞表型铺设已经生长数据，生长曲线的制作

二、 实验原理

1. 细胞铺设仅是操作，提供细胞特定生长环境并储存
2. 生长情况测定使用的是MTT法，即在培养基上使用MTT浸染孵育之后，细胞代谢过程会存在MTT内容物并生成蓝紫色结晶，而二甲亚砜可以将这种结晶溶解，并在震荡后混色均匀，用于吸光度的测定以反映细胞生长情况（活细胞） MTT法是一种检测细胞存活和生长的方法。MTT为黄色化合物,是一种接受氢离子的染料,可作用于活细胞线粒体中的呼吸链,在琥珀酸脱氢酶和细胞色素C的作用下,外源性MT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒( Formazan)并沉积在细胞中,而死细胞无此功能。二甲基亚砜(DMSO)能溶解细胞中的甲瓒,用酶联免疫检测仪在490nm波长处测定其光吸收值,可间接反映活细胞数量。在一定细胞数范围内,MT结晶形成的量与活细胞数成正比 [1]  。

三、 实验器材

获得转染后24h的细胞可以铺设表型

1. 转染后24h的细胞培养基、96孔板（生长曲线）、6孔板（细胞克隆）、无菌枪头、EP管、10ml无菌管
2. 低营养培养液（低培）、胰酶液（用于使贴壁细胞脱落，隔断细胞间连接）、全营养培养液

四、 实验步骤

提前写好平板编号，对应孔数的EP管，10ml管

1. 用胰酶液消化细胞。用1ml低营养培养液（5ml全营养培养液+45ml双无培养液）重悬细胞。转染之后的不同组别需要更换抢头

2. 细胞计数（大概在镜下查看各组细胞量的多少），+10µl计数板上计数

3. 计算+悬液量

   names	density	volume of cell suspension	volume of complete nutrient medium(CNM)
   NC/VECT	a	800/a	1000-800/a
   1#	b	800/b	1000-800/b
   ...
   已计算得到：800/a意味着，当加入800/a µl的 a 浓度的细胞悬液的时候，其包含了80000个细胞在内，1000- 800/a 是使用全营养培养液补齐1000µl

4. 10ml管一起配置，先加入7ml的全营养培养液，然后加入1000-800/a 的全营养培养液，然后加入800/a的细胞悬液，震荡摇匀。

   1. 测生长曲线的96孔板，按照组别每孔+20µl ；五块板，观测五天
   2. 制作细胞克隆的6孔板，先摇晃混匀之后，每孔+100µl细胞悬液，+2ml全营养培养液； 第五天需要更换营养液（已贴壁，直接更换），2-3天即可收样使用，此步完成细胞的克隆

5. 测定细胞生长曲线

   1. 配置MTT溶液：

      1. 5mg/ml ，使用PBS缓冲液配制：0.25g MTT粉末+50ml PBS
      2. 裹上锡纸避光，封上封口膜，在37°C水浴锅中溶解完全
      3. 过滤：使用50ml针筒，在过滤器中过滤。使用完毕的针头需要用离心管封装后丢弃
      4. 4°C保存MTT溶液
   2. 测定生长曲线数据

      1. 上述配置的96孔板，每孔+20µl MTT溶液，于细胞箱中孵育4h，丢弃培养液，并尽量沥干
      2. 每孔+150µl的DMSO（二甲亚砜），震荡10min，使结晶物质充分溶解
      3. 在490nm下测定96孔板吸光度

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RNA的提取纯化&逆转录&荧光定量分析

一、 实验目的

1. 学习RNA的提取纯化
2. 学习RNA的逆转录
3. 学习RNA的荧光定量分析

二、 实验原理

1. Trizol溶液（RNA抽提剂）： 可提取总RNA，迅速破碎细胞并抑制细胞释放出的核酸酶。 苯酚、异硫氰酸胍 苯酚（主要）：裂解细胞、使蛋白，核酸等物质得到解聚和释放 异硫氰酸胍：抑制内外RNAse（RNA酶）的活性
2. 氯仿（使溶液分相） 三氯甲烷，使溶液分层为水相和有机相，在酸性环境下，RNA更易溶于水相，而pr和DNA更易溶于有机相
3. 异丙醇（使水相中RNA沉淀）： 异丙醇类似于乙醇，含有-OH，对水的亲和力很高，因此在异丙醇溶液中，RNA周围的水会被夺走，从而沉淀
4. DEPC水（无RNAse无DNAse水） 用RNA酶抑制剂处理过后的水，可以使获得的RNA溶液中的RNAse灭活
5. 测定纯化之后RNA的浓度并配置逆转录体系 根据浓度计算RNA的量，从而确定所需要配成的20微升的体系中另外两种试剂的量 另外两种试剂：DEPC水（补足20微升用）、商用RNA逆转录mix试剂（4微升） 因此RNA的量改变的是加入DEPC水的量
6. 提示

   1. 体系配制完成，到逆转录机器（PCR？）中完成逆转录，形成cDNA（complimentary DNA；互补DNA）；cDNA将比RNA更加稳定，则无须再继续在冰上操作，无低温要求。但需要注意的是，cDNA仍然是一条单链，只不过其内容是DNA序列。
   2. *这里存在的问题1是：在逆转录为cDNA的时候，原来的RNA单链是否会被RNA水解掉，从而在完成逆转录之后，仅会得到cDNA
   3. 问题2是：逆转录为cDNA的时候，是否一条RNA链只会被逆转录一次？如果被RNA酶水解之后，还会被再次逆转录吗？*
   4. 回答：如果温度可以控制反应过程，那么在形成RNA-cDNA的温度下，这个双链并不会解开，而此温度下，RNA也不会产生效果。当温度随程序改变，这个双链解开，RNA酶也到了工作温度开始发挥作用，而此时则离开了逆转录酶的工作温度，因此仅会谁接RNA，而不会再次发生逆转录过程。
7. 实时荧光定量分析 利用cDNA配制新的，实时荧光定量分析机器所需的体系：

   1. 原理为，得到的cDNA仅是与纯化RNA互补的序列，它仅是一条单链。且它的量与RNA的量是对等的。因此如果我们需要对原来的RNA序列进行定量分析，就可以利用CT（循环阈值）的概念对其进行扩增，根据其CT值定量获得其由cDNA反映的RNA的量。则，此阶段的原理就是对cDNA进行荧光标记并扩增，得到其循环阈值从而获得我们原本的RNA的量（浓度）的多少
8. cDNA扩增原理 cDNA可以直接作为模板形成第二条链，则两条链形成双螺旋的完整DNA链。并以此链在合适的条件下进一步扩增； 上游引物、下游引物？
9. 荧光标记 TB-green试剂：详见其说明书，用于实时荧光PCR的试剂

三、 实验器材

1. 无菌无酶枪头、EP管、PBS缓冲液、细胞已贴壁的培养基
2. Trizol试剂———从组织和细胞中分离总 RNA，包括富含脂肪组织和难提取样品
3. 氯仿———使溶液分相
4. 异丙醇———使水相中的RNA沉淀
5. DEPC水———无RNAse无DNAse水
6. 逆转录管、滤纸、冰盒、4°C离心机预冷

四、 实验步骤

1. 收样 无菌无酶枪头，EP管

   1. 吸掉培养基、冷的PBS洗两遍
   2. 加入500µl的Trizol，静置3-5min
   3. 吹打混匀，转移到EP管；（如果暂时不需要提取，则可冷冻倒-80°C保存）
2. 提取RNA 4°C离心机预冷、异丙醇预冷、一套无菌无酶的枪头，对应数量的无菌无酶的1.5ml的EP管。额外+1个EP管放DEPC水（N+1）、对应数量的逆转录管、滤纸、冰盒

   1. 每管（6孔板的1/2孔收的样）加100µl（200µl氯仿）可将氯仿先倒至50ml管中备用
   2. 上下颠倒（混合充分）10次+，冰上静置2-3min，离心（12000rpm，15min，4°C）在等待离心时可以先给一套新的EP管编号、配置75%的乙醇预冷
   3. 取上清液，200µl
   4. 1：1加入异丙醇（200µl），上下颠倒10次+，冰上静置10min，离心（1200rcf（g），10min）
   5. 倒掉液体，倒扣在滤纸上吸水
   6. 加入已预冷的1ml 75%乙醇，离心（7500 rcf（g），5min）
   7. 倒掉，倒扣在滤纸上吸水，空转离心（5000 rpm，3min）
   8. 用20µl枪头吸1-2次，吸干管中液体（在沉淀的对侧吸取），晾干1-2min
   9. 加入20µl的DEPC水溶解；（浓度高时可多加10µl）
   10. 测浓度，获得浓度a
3. 逆转录 配置逆转录所需的体系

   1. 体系总成20µl：（MIX试剂+RNA+RNAse Free水）DEPC水并不等同于RNAse Free水

      1. MIX固定4µl
      2. RNA的量为1000/a
      3. 配套水的量为：16-1000/a （补齐作用）
   2. 剩余RNA存至 -80°C备用
   3. 使用红色的PCR仪进行逆转录：“ZC”——“15min...”——使用已预设的模式完成 逆转录之后，我们的RNA将会被降解，而得到与原来RNA的量相等且序列配对的cDNA。该cDNA将会在荧光定量PCR中进行扩增，而根据其扩增情况得到的CT（循环阈值）即可判断该cDNA的含量，即反映了原本对应的不同RNA的不同含量
4. 实时荧光定量PCR 配置实时荧光定量PCR所需的体系

   1. 体系总成：10µl：（cDNA + TBGreen + ddH2O（高压无菌水） + Rox +F（引物） + R（引物））

      1. cDNA固定1µl
      2. TBgreen固定5µl
      3. ddH2O固定3.4µl
      4. Rox：0.2µl
      5. F：0.2µl
      6. R ：0.2µl 因为除cDNA外其他9µl的内容都是一样的，因此可先配置后续的9µl，并添加到多孔板中

   2. 版面设置：

      	PcDNA	CasP8	Tips
      GAPDH	ooo(Three wells)	ooo	1份内参体系，各自+cDNA
      Target GENE	ooo	ooo	1份目的基因体系，各自+cDNA

   3. 上机进行实时荧光定量PCR

      1. 上机、QuantStudio tm Real-Time PCR Software
      2. new Experiment
      3. which block are you use to run the experiment? ---384-well
      4. which reagents do you want to use to detect the target sequence?---SYBR Green Reagents
      5. what properties do you want for the instument run?---standard
      6. Assign 选孔（control点选），Targets [√]，sample[√]
      7. Run method : Reaction Volume per well : 10 µl
      8. Run ---start Run ---选择文件保存位置---“Yes”

   4. 下机要求

      1. 右上角"Analysis"进度条完成
      2. 左下"Export" ---"Results" --- "well position" "CT"
      3. Export File Location 改路径
      4. Save 整个程序
      5. Export

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DNA琼脂糖电泳

一、 实验目的

1. 学习DNA琼脂糖电泳的操作方式
2. 理解琼脂糖电泳的实验原理

二、 实验原理

1. DNA片段带负电，在通电的正负极环境中发生电泳，向着正极移动，其移动速率与其片段大小呈负相关；
2. 琼脂糖凝胶可通过调节其制作过程中的凝集浓度产生不同大小的凝胶小孔，浓度高的琼脂糖凝胶其孔径小，浓度低的琼脂糖凝胶其孔径大。小孔径的凝胶适合分离短片段的核酸、大孔径的凝胶适合分离长片段的核酸；
3. DNA片段在电场中涌动的过程将收到琼脂糖凝胶的阻碍，使得不同大小的DNA片段在凝胶中的相同时间内涌动的距离不同，从而将不同片段大小的DAN分子分离开来。这个过程中电场和琼脂糖凝胶共同形成了电泳和分子筛的效果
4. 在制作凝胶的过程中加入核酸显色剂，使之后的核酸电泳完成后在曝光中得以显色；全环境加入电泳缓冲液TB E提供良好的电泳离子环境；在边缘上样孔中加入Marker用于指示电泳结果中片段所在位置所指示的核酸长度；在上样过程中将样品和loading buffer混合上样，用于指示电泳过程的进行情况；具体作用见附图

   1. ![[截屏2022-10-04 15.44.17.png]]

三、 实验器材

1. DNA电泳仪、锥形瓶、超净工作台（凝胶配置）、微波炉、热隔离手套、10微升、10微升枪头
2. AGAR琼脂糖粉、0.5xTBE（缓冲液）、核酸染料、loadingBuffer（上样缓冲液）
3. 纯化DNA样品、Marker DNA样品

四、 实验步骤

1. 琼脂糖凝胶的配置

   1. 1.5g琼脂糖粉+100ml 0.5xTBE于锥形瓶中混合均匀，放入微波炉中加热（中高火），nmin，煮至沸腾（冒出透明大气泡）；煮的过程中避免液体冒泡溢出，可多次暂停取出摇匀，直至液体整体沸腾冒大气泡
   2. 煮沸完毕移至超净工作台，+5微升核酸染料，摇晃均匀，倒入模具中，安装梳排，必要时使用枪头清理小气泡，避免胶体凝固出现气泡。拉低工作台挡板，等待凝固（需要足够的时间等待凝固）
   3. 凝固后，拔除梳排，从模具中提出凝胶，推入加满0.5x TBE环境（TBE漫过胶面）的DNA电泳仪中，方向为DNA电泳方向正对正极。（黑——>红）
2. 加样

   1. Marker DNA加样（AL2000 DNA Marker），根据说明书加入5微升至Marker加样孔
   2. 在塑料薄膜手套上混合DNA样品与上样缓冲液（LoadingBuffer）：5微升loading buffer+1微升DNA样品，然后加样至凝胶中。
   3. 盖上电泳仪上盖，160v、30min完成电泳
3. 凝胶曝光

   1. 直接将电泳完毕的凝胶放入曝光仪器中适当位置。选择核酸凝胶项目——>EB，调整滤光片完成曝光，获得DNA琼脂糖凝胶电泳结果。