留胡子的豆腐

V1

2022/02/14阅读:70主题:萌绿

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应用场景|通过mRNA技术在体内表达抗HER2抗体

当前99%的国内RNA药物研发公司把人力财力全部投入到新冠疫苗的研发中,挤破头也要抢着拿到IND,你卷我卷大家一起要卷死在新冠疫苗赛道上。连非洲黑哥哥都搞出来mRNA疫苗,你就知道这行门槛有多低。正是这种低门槛,诱人的捷径,让大家意识到可以四两拨千金,挑战传统药企巨头。谁能第一个上市推出国产新冠mRNA疫苗,那还不得成为创新药研发行业的明珠,皇冠加身,钱就来了。有钱了,人就来了,其他管线也就铺开了。完全可以理解,为啥这么多人前赴后继往新冠疫苗这个坑里跳,你不跳,你不赌,就没有一飞冲天的机会。一将功成万骨枯,同质化的研发,过于惨烈,实属无奈之举。大浪淘沙,强者恒强,慢就意味生存的艰难。很少有人愿意坐冷板凳耗费数年去真正做点东西,一万年太久,争朝夕,鹊声名,上市捞钱。

实际上,mRNA技术除了应用于新冠疫苗,还可以应用到很多有意思的领域。哪里有蛋白,哪里就是mRNA突破的机会。2019年,Daniel G. Anderson发表在Molecular Cell上的文章: mRNA Delivery for Therapeutic Anti-HER2 Antibody Expression In Vivo,今天给大家分享Daniel G. Anderson的这篇文章,提供一种思路,通过mRNA技术平台在体内表达抗体药物

抗体药物 VS mRNA药物

抗体药物(antibody-based durg)是一类重要的靶向药物,应用于癌症,慢性炎症,自身免疫疾病的治疗。然而,大规模抗体生产会面临很多挑战,需要付出高昂的生产成本:

  1. 抗体纯化工艺流程是复杂的,而且特定的抗体常常需要开发适应于自身的特定纯化工艺。
  2. 哺乳动物细胞表达抗体蛋白时,异常翻译后修饰发生的频率很高,这使得大量的,高成本的质量控制成为必需。
  3. 表达抗体的哺乳动物细胞系非常容易发生突变,需要高昂的费用去维持细胞系的稳定性。
  4. 抗体本身非常容易被血清中的酶快速清除降解。在某些情况下,快速的抗体清除会导致频繁的药物服用,从而造成治疗成本的上升,还可能导致副作用的产生,甚至激活免疫系统。

相比之下,将mRNA技术应用于抗体药物,拥有诸多优势:

  1. IVT-mRNA已经被证实可以在体内表达高水平的蛋白。
  2. 面对不同的抗体,IVT-mRNA生产工艺是通用的,不需要不断重新开发新的工艺。
  3. IVT-mRNA生产不需要细胞系,属于化学合成路线。
  4. IVT-mRNA使得抗体结构的优化大大简化,只需要改变mRNA序列即可。
  5. 使用IVT-mRNA技术时,人体细胞成为抗体生产的场所,更有利于抗体翻译后修饰的控制,而且可以直接靶向细胞内靶点。
  6. 尽管mRNA非常不稳定,但是合成的时候引入修饰碱基可以极大地改善mRAN稳定性,并且减少免疫原性。
  7. IVT-mRNA发挥功能不需要进入细胞核,宿主细胞发生整合突变的概率是非常小的。

曲妥珠单抗

曲妥珠单抗(trastuzumab)是一种靶向人类表皮生长因子受体II(HER2)的单克隆抗体药物。将近30%的乳腺癌(breast cancer)病人体内人类表皮生长因子受体II存在过度表达,曲妥珠单抗主要用于治疗某些HER-2阳性乳腺癌病人。

人类表皮生长因子受体II(HER2)是一种细胞膜上的受体,能够识别人类表皮生长因子EGF,发生特异性结合,引发自提磷酸化,向细胞内传递信号,维持细胞的正常生长分裂。一旦HER2过度表达,会导致细胞受到过度的刺激,造成细胞异常的快速生长,进而触发癌症的发生。

曲妥珠单抗为人源化的单克隆抗体,能够与HER-2发生特异性结合,阻止EGF与HER-2结合,进而延缓癌细胞生长。此外,曲妥珠单抗能诱发体内免疫作用,包括抗体依赖型细胞毒作用与补体毒杀作用,进而造成被单克隆抗体识别的靶标细胞死亡。有研究显示,曲妥珠单抗在敲除Fc受体的小鼠体内抑制肿瘤的效应会极大消减【PMID: 10742152】。

接下来,我们详细看看选择哪些元件来搭建Trastuzumab mRNA才能够在体内高效表达Trastuzumab ?

设计优化Trastuzumab-mRNA序列

Trastuzumab mRNA序列元件构成

  1. Cap1

  2. 5'UTR

    a partial sequence of the cytomegalovirus (CMV) immediate early1 (IE1) gene

  3. The signal peptide sequence

    大多数分泌蛋白的N端有一段16-20个氨基酸的信号肽序列(SP),信号肽对于蛋白的分选和分泌是非常重要的。尽管在不同的蛋白,不同的物种中,信号肽的序列差别非常大,但是从功能上来说,不同的信号肽之间可以发生交换。

    • 用GLuc SP替换人血管内皮抑制素(endostatin)的天然SP,可以提升endostatin蛋白的表达量和分泌水平。有意思的是,尽管在血清中,albumin 和interleukin-2分泌水平非常高,但是GLuc SP对于endostatin蛋白的表达量和分泌水平的提升作用要好于albumin 或者interleukin-2 SP【PMID: 17316861】。
    • 用 human immuno globulin light chain kappa (hIgLCk) SP 替换掉 cytokine-like 1 (CYTL1) protein天然的SP,显著提升该蛋白的表达量【PMID: 26922322】。
    • 有研究证实 human IgG1 heavy and light chain SP sequences, H5/L1 SP 组合是Trastuzumab最优的SP组合。【PMID: 25706993】
  4. 抗体蛋白CDS序列

    一般来说,大部分重组治疗性抗体蛋白的序列可以在公共数据库(DrugBank)中找到,但是这些序列经常不包含有SP,因此最高效的SP序列需要通过试验来确定。当我们在DrugBank找到蛋白序列以后,需要转换成mRNA序列,并且进行密码子优化,以有利于在哺乳细胞中的翻译表达。

    • 把trastuzumab mRNA序列和不同的SP序列拼接在一起,转染细胞,找到最高效的SP序列。试验数据显示,细胞内trastuzumab的表达没有因为不同的SP产生显著的差异,但是hIgLCk SP-trastuzumab mRNA在培养基中分泌的trastuzumab水平要好于另外两个SP-mRNA,因此选择hIgLCk SP作为trastuzumab的信号肽序列

      把不同SP-trastuzumab mRNA转染mouse hepatocytes(AML-12 cells),24h以后用ELISA测定trastuzumab 在细胞裂解液和培养基中的表达量
      把不同SP-trastuzumab mRNA转染mouse hepatocytes(AML-12 cells),24h以后用ELISA测定trastuzumab 在细胞裂解液和培养基中的表达量
      不同的信号肽序列
      不同的信号肽序列
  5. 3'UTR

    a partial sequence of the human growth hormone (hGH) gene

  6. 3' polyA tail

    120nt 长度

    编码trastuzumab 重链和轻链的mRNA序列元件搭建
    编码trastuzumab 重链和轻链的mRNA序列元件搭建

确定重链HC-mRNA和轻链LC-mRNA比例

有研究显示随着mRNA长度的增加,蛋白翻译速率会下降。由于human IgG1重链mRNA长度是轻链mRNA长度的2倍,Daniel G. Anderson推测相比于轻链的翻译速度,重链缓慢的翻译速度限制了IgG1的组装和分泌。因此Daniel G. Anderson测定提升重链和轻链mRNA比例是否会增加抗体蛋白合成量。

把不同比例的重链(HC)和轻链(LC)mRNA转染AML-12细胞,结果发现1:2 LC:HC mRNA比例,培养基中分泌的trastuzumab水平最高。继续提升HC mRNA比例,蛋白合成水平发生下降,可能是由于轻链合成的速度受限,无法提供足够多的轻链给重链组装形成完整的抗体。

令人感到意外的是,小鼠体内表达的数据显示不同比例(LC:HC)的mRNA体内的表达效果并没有发生非常显著的差距。由于体内表达的平均值,1:2 LC:HC 是最高的,因此本研究确定该比例为LC mRNA和HC mRNA的比例。

把重链和轻链mRNA按照不同的比例转染AML-12 cells细胞或者通过LNP递送到小鼠体内,24h后检测蛋白表达情况
把重链和轻链mRNA按照不同的比例转染AML-12 cells细胞或者通过LNP递送到小鼠体内,24h后检测蛋白表达情况

Trastuzumab -mRNA 全长序列

Trastuzumab重链和轻链mRNA全长序列
Trastuzumab重链和轻链mRNA全长序列

在小鼠体内Trastuzumab -mRNA-LNP的蛋白表达验证

在非人类灵长目动物中(non-human primates),cKK-E12(MD-1)被证实可以选择性将siRNA递送到肝实质细胞,因此选择cKK-E12(MD-1)纳米颗粒包裹mRNA。

试验数据显示,mRNA注射剂量和Trastuzumab 表达水平存在剂量依赖效应,当mRNA注射剂量达到2 mg/kg,Trastuzumab 在血清当中的浓度是40 ug trastuzumab/mL。当注射2 mg/kg mRNA时,第7天,小鼠血清中Trastuzumab 可以达到57.5 ± 7.6 mg/mL 。

Trastuzumab -mRNA-LNP体外功能验证

为了验证通过Trastuzumab -mRNA-LNP产生的trastuzumab是否具有抗肿瘤活性,从注射Trastuzumab -mRNA-LNP血清当中回收trastuzumab,把血清中分离得到的trastuzumab和HER2-positive breast cancer cells(BT-474 and SK-BR-3) 一起孵育,结果发现,与对照组相比,SK-BR-3 细胞的存活率发生了下降,但是BT-474存活率没有发生改变。

接下来验证Trastuzumab-mediated ADCC,Trastuzumab可以和靶细胞(HER2-positive breast cancer cells)上面的HER2发生特异性结合,然后effector cell 识别Trastuzumab的Fc片段,导致靶细胞裂解。结果显示,当HER2-positive breast cancer cells(BT-474 and SK-BR-3)和trastuzumab,PMBCs一起孵育的时候,可以非常显著地降低ER2-positive breast cancer cells 存活率。

总结来说,通过RNA技术在小鼠体内产生的Trastuzumab可以通过两种方式造成HER2-positive breast cancer cell 死亡,一种是通过跟细胞表面的HER2-receptor结合,抑制HER2-positive breast cancer cells的生长分裂;另外一种是激活ADCC作用,导致HER2-positive breast cancer cells裂解。

Trastuzumab -mRNA-LNP体内功能验证

  1. 构建HER2-positive human breast cancer小鼠模型

    首先构建HER2-positive human breast cancer小鼠模型(xenograft-bearing mice),把HER2-expressing plasmid导入到MDA-MB-231 cells 里面,产生MDA-MB-231-HER2,从而产生对trastuzumab敏感的细胞系。

  2. 验证cKK-E12 LNPs体内的递送效果

    已经有研究表明cKK-E12 LNP递送的mRNA主要在肝脏细胞中表达,有非常小的一部分在脾脏中表达。本研究中研发人员在小鼠体内注射2 mg/kg cKK-E12 LNPs包裹的 firefly luciferase (FLuc) IVT-mRNA,注射6h 后,可以看到LNPs 主要积聚在肝脏中,少部分在脾脏中。肿瘤细胞中也存在非常少量的荧光信号。

     携带肿瘤的小鼠注射Firefly liciferase (Fluc) mRNA-LPNs,全是荧光信号分布情况
    携带肿瘤的小鼠注射Firefly liciferase (Fluc) mRNA-LPNs,全是荧光信号分布情况
  3. 验证Trastuzumab -mRNA-LNP对肿瘤生长的抑制效应

    MDA-MB-231 or MDA-MB-231-HER2 xenografts小鼠模型隔周注射2 mg/kg trastuzumab mRNA LNPs ,总共注射4次,可以看到在治疗开始阶段,肿瘤大小约150 mm3 ,与HER2-negative tumors小鼠模型相比,HER2-positive tumor growth小鼠的肿瘤生长速度在接触治疗后开始出现滞后。第四次注射完成一周以后,HER2-positive tumors大约是100mm3 ,相比之下HER2-negative tumors要比其大4倍左右。另外,与携带HER2-negative tumors小鼠相比,HER2-positive tumor growth小鼠有更长的存活率。

    携带HER2-negative tumors和HER2-positive tumor小鼠,注射 trastuzumab mRNA LNPs后,生长情况比较
    携带HER2-negative tumors和HER2-positive tumor小鼠,注射 trastuzumab mRNA LNPs后,生长情况比较

    总结

    mRNA技术平台可以广泛应用于临床治疗中,包括疫苗,蛋白替代治疗,基因编辑等。治疗性抗癌疫苗可以靶向肿瘤相关抗原,激活T cell Responses,正在被用于临床研究中。使用LNP-formulated IVT-mRNA可以避免抗体生产过程中的各种不利因素,借助于宿主本身的翻译系统,可以表达高水平的经过正确折叠修饰的抗体蛋白。这篇文章为通过mRNA技术在体内高效表达单克隆抗体提供了一种可行的技术路线,尤其是如何选择元件搭建最优的mRNA序列,对于mRNA药物公司新药研发管线的建立具有非常有益的启发作用

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后端

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