🤫 Seurat | 强烈建议收藏的单细胞分析标准流程（经典归一化与降维方法）（二）

1写在前面

为了做进一步的分析，我们需要对数据进行归一化（Normalization）和标准化（Z-score）。😘
这里我们介绍一下经典的Normalization方法，这个方法假设所有细胞均含有10,000个UMI。🐶

2用到的包

rm(list = ls())
library(Seurat)
library(tidyverse)
library(SingleR)
library(celldex)
library(RColorBrewer)
library(SingleCellExperiment)

3示例数据

这里我们还是使用之前建好的srat文件，我之前保存成了.Rdata，这里就直接加载了。✌️

load("./srat.Rdata")
srat

4归一化

Note! 这里做的是log-normalization， 大家不要重复取log。🥰

srat <- NormalizeData(srat)

5高变基因

5.1 计算高变基因

找一下高变基因吧，这里补充一下可用的方法：👇

• vst
• mvp
• disp

srat <- FindVariableFeatures(srat, selection.method = "vst", nfeatures = 2000)

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5.2 Top 10

我们取一下高变基因的top10，在后面的可视化中标注出来。

top10 <- head(VariableFeatures(srat), 10)
top10 

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5.3 可视化

plot1 <- VariableFeaturePlot(srat)
LabelPoints(plot = plot1, 
            points = top10, 
            repel = TRUE, 
            xnudge = 0, 
            ynudge = 0)

6标准化

细心的小伙伴肯定发现了gene的表达差异较大，这样做出来的图就会不好看。😤
我们在这里接着做一个Z-score, 将Normalization后的数据转为均值为0，标准差为1的数据。🧐

all.genes <- rownames(srat)
srat <- ScaleData(srat, features = all.genes)

7主成分分析

大家可以通过features参数设置纳入PCA的基因数。🌟
这里我们取前2000个高变基因进行分析。

srat <- RunPCA(srat, 
               features = VariableFeatures(object = srat))
## 可视化
VizDimLoadings(srat, dims = 1:9, 
               reduction = "pca") + 
  theme(axis.text=element_text(size=5), 
        axis.title=element_text(size=8,face="bold"))

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当然你也可以用热图的形式来展示结果。😁

DimHeatmap(srat, dims = 1:6, nfeatures = 20, cells = 500, balanced = T)

8选取多少PC才合适？

我们先看一下UMAP图。👀

DimPlot(srat) # umap, then tsne, then pca

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通过ElbowPlot我们可以发现，在10的地方有明显的下降。🤟

ElbowPlot(srat)

9聚类

9.1 开始聚类

之前确定了10个PCs最合适，这里我们将PC1:10纳入，进行聚类。
这一步非常重要，因为后面marker的选择要基于聚类的结果。 💪

srat <- FindNeighbors(srat, dims = 1:10)
srat <- FindClusters(srat, resolution = 0.8)

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UMAP降维。🐹

srat <- RunUMAP(srat, dims = 1:10, verbose = T)

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这个时候我们就有一个新的clusters信息了，看一下吧。🙊

table(srat@meta.data$seurat_clusters)

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9.2 聚类结果可视化

1️⃣ 质控前~

DimPlot(srat,label.size = 4,repel = T,label = T)

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2️⃣ 质控后~

srat <- subset(srat, subset = QC == 'Pass')
DimPlot(srat,label.size = 4,repel = T,label = T)

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9.3 聚类效果简单评价

这里给大家提供一个简单的评价方法，假设我们已知: 👇

• 树突状细胞(DCs)的marker是：LILRA4 和 TPM2;
• 血小板(platelets)的marker是：PPBP 和 GP1BB。

我们看下这些marker是否都显著表达在一类细胞群中。🤨

FeaturePlot(srat, features = c("LILRA4", "TPM2", "PPBP", "GP1BB"))

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最后祝大家早日不卷!~

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需要示例数据的小伙伴，在公众号回复Seurat获取吧！

点个在看吧各位~ ✐.ɴɪᴄᴇ ᴅᴀʏ 〰