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2022/10/02阅读:20主题:雁栖湖

🤩 scRNA-seq | 吐血整理的单细胞入门教程(从原理到代码实操)(一)

1写在前面

炙手可热的单细胞测序scRNA-seq)大家肯定都或多或少听过一些,从今天开始陆续分享我的学习笔记,有不对的地方大家多指正~🤒

在开始前我们先思考几个问题,如下:👇

Q1: 什么是scRNA-seq,它与bulk RNA-seq相比如何?

Q2: scRNA-seq有哪些典型应用?

Q3: scRNA-seq如何准备样品?

2什么是scRNA-seq?

2.1 什么是bulk RNA-seq

要搞懂什么是scRNA-seq,我们先了解一下bulk RNA-seq。 🥳

RNA-seq用于由细胞混合物组成的样本中,称为bulk RNA-seq,常用于研究control/diseasedwild-type/mutant之间的转录组差异。

然而,使用bulk RNA-seq,我们只能估计每个基因在细胞群中的平均表达水平☹️,没有考虑该样本中单个细胞基因表达的异质性

举个栗子🌰,早期发育研究或大脑等复杂组织。


2.2 scRNA-seq横空出世

为了解决异质性的问题,2009年首次报道了单细胞水平的RNA-seq,即scRNA-seq

bulk RNA-seq不同的是,使用scRNA-seq可以评估每个基因在不同细胞群中的表达水平分布。🤩

成功解决了转录组中细胞特异性变化的问题。可以发现新的或稀有的细胞类型,识别control/diseased组织之间的差异细胞组成或了解发育过程中的细胞分化


2.3 scRNA-seq图谱

目前有很多的scRAN-seq图谱,全面解析了不同物种中的细胞类型。举几个栗子🌰,如下:

  • Human Cell Atlas (H. sapiens)
  • Tabula Muris (M. musculus)
  • Fly Cell Atlas (D. melanogaster)
  • Cell Atlas of Worm (C. elegans)
  • Arabidopsis Root Atlas (A. thaliana)

随着技术的进步,scRNA-seq方法学层出不穷,自首次报道后的技术发展,我们可以看到随着技术的进步,scRNA-seq可以检测到更多的细胞。

但需要说明一下,不同的技术各有其优缺点,还是老观点,新技术不一定是最好,选适合你的就行了。🧐

3scRNA-seq的样品制备

3.1 经典protocol

通常来说,经典的scRNA-seqprotocol可以分为以下几个步骤:

  • 从组织和细胞培养中制备细胞悬浮
  • 细胞筛选(基于表面marker、转基因技术、染色等)。(可选步骤😊)
  • 捕获单个细胞(如wellsoil droplets)。
  • 每个细胞中提取RNA
  • RNA反转录为cDNA
  • 扩增cDNA体外转录或 PCR)。
  • 准备测序文库,adapters
  • 测序。
  • 处理raw data以获得细胞基因的count矩阵
  • 进行下游分析。

3.2 制备样品困难怎么办?

在难以分离细胞的组织中或在冷冻组织样本中,可能较难实现单细胞的制备,我们可以选择制备单个细胞核样本。

Note! 但需要注意一下,核RNA通常含有较高比例的未加工unprocessed RNA,,会测序到大量含有introns的转录本。😲

具体的解决方案,我们后面再介绍吧。😘


3.3 常用protocol的对比

这里我们比较一下目前常用的protocol,这里不包括Smart-seq3Smart-seq3xpress,后面我们单独介绍这两种方法。

4细胞捕获

目前应用最广泛的三种方法为microtitre-plate, microfluidic-arraymicrofluidic-droplet

各有其优缺点,这里只做简单介绍,感兴趣的小伙伴可以去Google一下具体差异。

1️⃣ Microtitre-plate

  • 优点是建库之前可以对细胞进行观察,识别并丢弃受损的细胞等。
  • 缺点低通量

2️⃣ Microfluidic-array

  • 优点是通量比Microtitre-plate通量高,省试剂😂。
  • 缺点是不适合稀有细胞的处理。
  • 这里提醒大家要注意一下arraysnanowells大小问题。

3️⃣ Microfluidic-droplet

  • 优点是高通量,低成本。💰
  • 缺点当然也是低成本带来的啦😂,一般coverage都比较低,往往检测深度就不够了,transcripts比较少。

Tips! 如果用FACS分离细胞的话,可以染一下live/dead, 避免一些活力低的细胞影响结果。😘


最后祝大家早日不卷!~

点个在看吧各位~ ✐.ɴɪᴄᴇ ᴅᴀʏ 〰

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