大聪明321

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2022/07/11阅读:20主题:橙心

文献报告3——肺炎克雷伯菌诱导宿主代谢应激,促进对肺部感染的耐受性

一、文章信息

肺炎克雷伯菌诱导宿主代谢应激,促进宿主对肺部感染的耐受性

Klebsiella pneumoniae induces host metabolic stress that promotes tolerance to pulmonary infection. Cell Metab. 2022 May 3;34(5):761-774.e9. doi: 10.1016/j.cmet.2022.03.009

2022年5月 / Cell Metabolism / IF 31 / 纽约-哥伦比亚大学

文章摘要
文章摘要

肺炎克雷伯菌ST258菌株是院内感染相关肺炎的主要原因,其产生免疫刺激性LPS,可以激活炎症和细菌清除反应,但如何引起长期感染仍不清楚。

一方面,作者推测,细菌诱导宿主细胞代谢应激导致了宿主免疫抑制反应。原位代谢成像和转录组分析证明ST258激活宿主谷氨酰胺分解和脂肪酸氧化,这种富含氧化剂的微环境有利于免疫抑制骨髓细胞的累积,从而引发疾病耐受的免疫反应。

另一方面,细菌上调VI型分泌系统以适应有杀伤作用的呼吸道氧化物,生存能力增加,这一特性在ST258菌株中高度保守。因此,ST258广泛的院内感染很大程度上可以用宿主体内激发的促进疾病耐受的代谢活动来解释。

太长不看版:

1 代谢组结果证明,与高致病性Kp菌株相比,ST258菌株诱导的宿主代谢完全不同,特征是谷氨酰胺分解和脂肪酸-β-氧化(FAO)造成的呼吸道氧化剂应激

2 代谢组加实验表明, MKP103感染诱导的宿主呼吸道代谢组差异和细菌LPS无关,是由宿主代谢而不是细菌代谢决定的

3 单细胞测序表明,与LPS刺激相比,MKP103感染募集更少的M1(促炎)巨噬细胞和更多的(抑炎)MDSC细胞,产生免疫抑制微环境;另外验证了代谢组的结果

4 基因敲除小鼠的实验和互作转录组表明,Irg1表达的衣康酸指导宿主对MKP103的反应,抑制了过度炎症,促进了细菌的持续生存,并使宿主能够耐受这种感染

5 基因组测序加实验表明,MKP103上调T6SS以响应氧化剂应激,这一基因在全世界范围的ST258菌株中高度保守

二、背景

ST258型是产碳青霉烯类肺炎克雷伯菌,低毒高耐。

1 肺炎克雷伯菌ST258型感染是温和但致命的

ST258型肺克菌株导致全球医疗相关肺炎,使新冠病毒感染的病程复杂化,带来高发病率和死亡率。肺炎克雷伯菌是革兰氏阴性菌,通常会引发LPS介导的强烈促炎反应,发挥细菌清除作用,同时伴随着组织损伤。但是ST258菌株有所不同,其诱导的宿主免疫反应是相对温和的,尽管同样致命。

2 细菌代谢可能影响ST258触发的免疫反应

髓源抑制性单核细胞(myeloid-derived suppressor cells, MDSCs)是ST258菌株激活的免疫反应的重要组成部分,这些细胞通常在肿瘤中被发现,发挥免疫抑制作用影响肿瘤进展。细菌代谢可能影响在肺中诱发的宿主代谢反应的性质,这反过来将指导先天免疫信号传导和细菌适应。即细菌通过代谢促使髓源抑制性单核细胞激活,抑制宿主免疫反应,进而帮助自身在机体内存活。

三、研究方法

代谢组、单细胞转录组、互作转录组、基因组测序、基因敲除小鼠、表型实验(体内、体外)等

四、研究结果

1 与高致病性Kp菌株相比,ST258菌株诱导的宿主代谢完全不同

(1) 代谢组实验设计

使用ST258分离株MKP103、高毒株KPPR1(ATCC43816)以及各自的LPS纯化物,滴鼻途径感染小鼠,对照组使用PBS和来自大肠杆菌的LPS,一共3组6种刺激物。

分组 菌株 剂量 LPS 剂量
对照组 PBS 50uL E.coli LPS 50mg
低毒组 MKP103 1×10 CFU MKP103 LPS 50mg
高毒组 KPPR1 1×10 CFU KPPR1 LPS 50mg

KPPR1的剂量选择:在避免急性致死的前提下,保证和MKP103感染有相似的菌载量、呼吸道免疫细胞数量、小鼠体重减轻和细胞因子水平。

48h后收集肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid,BALF),进行代谢组检测。

后续单细胞测序剂量和时间与代谢组一致。

(2)结果(这里没有代谢基础,细节部分看不懂)

过去的研究表明(Tannahill et al.,2013),宿主对KP的免疫代谢反应,受LPS诱导的促炎信号支配,包括糖酵解增加、HIF-1α(缺氧诱导因子-1α,正常很快被降解,缺氧时稳定表达)稳定和IL-1b产生。

图1-A 宿主对KP的免疫代谢反应
图1-A 宿主对KP的免疫代谢反应

①但是代谢组PCA结果显示,MKP103感染的宿主代谢和KPPR1或LPS引起的代谢反应完全不同(各个点的位置关系代表了彼此间的相关性,每组5个重复)。

图1-B 不同分组样本的PCA
图1-B 不同分组样本的PCA

②和PBS组相比,MKP103代谢物中,葡萄糖和谷氨酰胺水平下调(谷氨酰胺分解,会生成谷氨酸),这和L-谷氨酸和中链脂肪酸(FA)衍生物(强大的抗菌活性)上调有关。

图1-C BALF代谢物热图
图1-C BALF代谢物热图

③富集分析揭示了MKP103感染对尿素循环以及精氨酸、酮体、天冬氨酸、苯丙氨酸和谷胱甘肽(一种主要的细胞抗氧化剂,由谷氨酸合成)代谢的激活。

图1-D 富集分析
图1-D 富集分析

④使用解吸电喷雾电离质谱分析(DESI-MS)对感染肺成像,证明两种KP菌株诱导的宿主代谢差异显著。谷氨酸、α-酮戊二酸和氧化十八烷酸在MKP103感染的肺组织中很容易观察到,但在KPPR1感染的肺组织中没有,这与通过【谷氨酰胺分解和脂肪酸-β-氧化】产生能量一致,GSH也是如此。

线粒体代谢物衣康酸在MKP103感染的肺中表达显著,而衣康酸与脂肪酸-β-氧化介导的ROS产生相关,在炎症抑制中起主要作用。

图1-E DESI-MS
图1-E DESI-MS

总的来说,MKP103诱导了以谷氨酰胺分解和脂肪酸-β-氧化增加为特征的宿主代谢反应。

2 MKP103感染诱导的宿主呼吸道代谢组差异和细菌LPS无关

①由于不同菌株的LPS存在特异性修饰,可能影响免疫代谢反应。研究人员通过飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)分析了两种Kp菌株LPS的免疫原性脂质A部分。结果显示,二者间只存在微小的修饰差异(氨基拉比安和棕榈酸盐)。

图S1-F 飞行时间质谱
图S1-F 飞行时间质谱

②根据免疫细胞的诱导、小鼠体重减轻和细胞因子的检测,两种菌株的LPS微小差异没有显著影响呼吸道代谢组和免疫原性。

图S1A-E 免疫细胞数、体重损失、细胞因子
图S1A-E 免疫细胞数、体重损失、细胞因子

③热灭活的MPK103和MPK103LPS诱导相似的代谢组反应,但均和活的MPK103不同。

图1-C BALF代谢物热图
图1-C BALF代谢物热图
图S1-G 热灭活MPK103和LPS诱导的代谢组
图S1-G 热灭活MPK103和LPS诱导的代谢组

因此,与MKP103感染相关的独特代谢组反应和LPS的菌株特异性差异无关。

3 MKP103感染诱导的宿主呼吸道代谢组差异是宿主代谢决定(define)的,而不是细菌代谢

宿主和病原体都会在受感染的呼吸道中产生代谢物。不同Kp菌株产生的代谢物可以导致整个呼吸道代谢组的差异。当然,感染期间的宿主反应也可能是形成代谢组的主要因素。


①MKP103和KPPR1在底物偏好上有很大差异,包括糖类、有机酸和氨基酸等。也就是说,和MKP103相比,KPPR1更偏好于吸收上述物质,这一结果在2021年的文献中有过报道(Ahn et al.,2021)。

图1-F KPPR1相对MKP103的碳源同化(以相同碳源下MKP103的OD590nm吸光度为参照)
图1-F KPPR1相对MKP103的碳源同化(以相同碳源下MKP103的OD590nm吸光度为参照)

②进一步探究脂肪酸氧化和合成缺陷的MKP103突变株的宿主代谢组,如果是细菌代谢导致MPK103诱导独特的宿主代谢反应,那么突变株的宿主代谢组应该和MKP103野生株存在差异。然而,结果显示,突变株与MKP103野生株没有差异。


这表明细菌(KP)代谢活动本身不是宿主呼吸道代谢组差异的主要来源。


前面提到,MKP103诱导了以【谷氨酰胺分解和脂肪酸-β-氧化增加】为特征的宿主代谢反应。

③进一步,为了确定宿主激活【谷氨酰胺分解和脂肪酸-β-氧化】可以应对MKP103感染,分别用【谷氨酰胺分解】和【脂肪酸-β-氧化】的抑制剂——限速酶谷氨酰胺酶-1(BPTE)和肉碱棕榈酰转移酶-1(Etomoxir)抑制剂处理小鼠,已确认两种药物不抑制MKP103生长(见文章副图S2-C/D,此处不展示)。

和溶剂对照组(Vehicle)相比,给予两种药物后,小鼠细菌载量上升、促炎细胞因子水平上升,而吞噬细胞(AM、Mono、Neu)的募集没有显著增加。(这里可以理解为,给与抑制剂之后,MPK103感染引发的宿主免疫反应强度提升了)

图2-G 处理后小鼠的肺载菌量、细胞因子和吞噬细胞水平
图2-G 处理后小鼠的肺载菌量、细胞因子和吞噬细胞水平

④处理后小鼠的肺中观察到GSH和衣康酸(由MKP103感染激活的宿主抗氧化反应的主要成分)的诱导较低。(正常情况下,MKP103诱导宿主GSH和衣康酸代谢增加)

图2-H 处理后小鼠肺GSH和衣康酸的水平
图2-H 处理后小鼠肺GSH和衣康酸的水平

⑤单独抑制【谷氨酰胺分解】或【脂肪酸-β-氧化】不会改变细菌清除率。

图S3-C/D 单独给予单一抑制剂后的细菌载量
图S3-C/D 单独给予单一抑制剂后的细菌载量

总之,宿主对MKP103感染的反应决定(define)了MKP103感染诱导的宿主呼吸道代谢组差异。

4 与LPS刺激相比,MKP103感染募集更少的M1(促炎)巨噬细胞和更多的MDSCs(抑炎)

对MKP103的独特代谢反应的生物学意义是——其在形成免疫反应中的作用,特别是不能有效的清除细菌。

①scRNA-seq揭示了MKP103感染后小鼠肺中的免疫细胞群。在LPS和MKP103刺激的小鼠肺组织种,一共检测到28种细胞类型(A上),不同分组之间的UMAP图存在差异(A左下)。

图3-A 单细胞测序(每组1只小鼠)
图3-A 单细胞测序(每组1只小鼠)

②对单核/巨噬细胞和中性粒细胞分别聚类,还检测到了M-MDSC(单核细胞-髓源抑制性细胞)和G-MDSC(粒细胞-髓源抑制性细胞)。

图S4-A-D M-MDSC(单核细胞-髓源抑制性细胞)和G-MDSC(粒细胞-髓源抑制性细胞)
图S4-A-D M-MDSC(单核细胞-髓源抑制性细胞)和G-MDSC(粒细胞-髓源抑制性细胞)

关于这两种细胞,更深入的了解,可以参考下面这篇文章(点击图片查看)。

DOI: 10.1016/j.immuni.2021.04.004. MDSC: Markers, development, states, and unaddressed complexity
DOI: 10.1016/j.immuni.2021.04.004. MDSC: Markers, development, states, and unaddressed complexity

③与LPS刺激的小鼠相比,MKP103感染后的巨噬细胞,特别是巨噬细胞亚群I,具有显著较低的M1评分。两组巨噬细胞的M2评分相似。也说明严格的巨噬细胞M1/M2二分法并不适用所有情况,在这里M1/M2巨噬细胞是混杂在各个亚群之中的,具有表型之间的连续性。

图3-B M1/M2评分
图3-B M1/M2评分

④接下来比较巨噬细胞代谢基因的表达,发现来自MKP103感染的巨噬细胞亚群,特别是肺泡巨噬细胞(AM),显著上调了脂肪酸-β-氧化(FAO)和谷氨酰胺分解(Glutaminolysus)评分。

图3-C 代谢基因在巨噬细胞的表达
图3-C 代谢基因在巨噬细胞的表达

⑤MKP103感染期间,肺泡巨噬细胞中参与过氧化物酶体增殖物激活受体(PPAR)信号传导(促进FAO,而非GSH代谢)的基因转录也上调。

图3-D PPAR信号转导基因在巨噬细胞表达
图3-D PPAR信号转导基因在巨噬细胞表达

总的来说,和LPS相比,MKP103感染后,小鼠肺中促炎的M1型巨噬细胞更少。而巨噬细胞上调了脂肪酸-β-氧化(FAO)和谷氨酰胺分解(Glutaminolysus)。


⑥接下来,作者讨论了MDSC群体,这些细胞存在巨大的异质性(Hegde et al.,2021)。与G-MDSCs不同,与LPS刺激相比,M-MDSCs在MKP103感染期间富集(增加),G-MDSC没有变化。这些MDSC种群在MKP103感染中的代谢影响包括显著上调的谷氨酰胺分解(FAO虽然有统计学差异,但差异可以忽略不计)。

图3E-G MDSC
图3E-G MDSC

⑦作者还研究了免疫细胞群体中Irg1/Acod1表达的分布,因为衣康酸是对感染作出代谢反应的主要成分(已被证明是一种抗炎成分)。结果显示,它在许多骨髓细胞中的强表达,特别是在MDSC群体中。

图3-H 衣康酸相关基因Arg1的表达情况
图3-H 衣康酸相关基因Arg1的表达情况

总的来说,scRNA-seq分析提供了强有力的证据,表明特定的代谢途径——特别是谷氨酰胺分解、脂肪酸-β-氧化(FAO)和衣康酸的生成——与宿主对活细菌感染的反应有关。

这里作者为什么偏偏瞄准巨噬细胞和MDSC细胞,是因为ST258型KP菌株诱导的宿主免疫反应,相较其他KP菌株,更加温和。作者推测,可能是由于细菌诱导宿主代谢,激活了宿主的免疫抑制反应。而M2型巨噬细胞和MDSC是发挥主要免疫抑制作用的免疫细胞。——编者

5 Irg1的表达指导宿主对MKP103的反应

MKP103感染后呼吸道衣康酸(ITACONATE)的表达显著增高。 图1-C BALF代谢物热图

①进一步分析发现,与WT相比,Irg1-/-小鼠的呼吸道和脾脏中细菌载量明显较高,促炎细胞因子水平上升,而吞噬细胞(AM、Mono、Neu)的募集没有显著增加。将宿主健康和感染状态联系起来的曲线斜率(1/促炎细胞因子水平,促炎细胞因子水平越高,斜率越小)表明,WT小鼠具有更高的疾病耐受能力。

图5-A/B Irg1-/-小鼠的细菌载量、细胞因子水平和吞噬细胞数量
图5-A/B Irg1-/-小鼠的细菌载量、细胞因子水平和吞噬细胞数量

②互作转录组测序显示,和WT相比,Irg1-/-小鼠的炎症和应激反应相关基因显著变化,包括IL-6(上调)、Atf3/4(应激诱导转录因子,上调)及其负反馈调节因子Trib3(上调)等,RT-PCR验证了这些结果。

图5-C 转录组测序和RT-PCR
图5-C 转录组测序和RT-PCR

③富集分析确定了在缺乏Irg1的情况下ATF3(应激诱导转录因子)介导的信号转导增加,以及被指定为氧化应激和炎症增加的应答者的基因的正向富集。

图5-D GSEA富集分析
图5-D GSEA富集分析

④在缺乏Irg1的情况下,MDSCs数量减少,特别是G-MDSCs,肺部肺泡萎陷和水肿增加,与炎症增加一致。

图5-E/S5-E MDSC变化和肺组织病理
图5-E/S5-E MDSC变化和肺组织病理

综上所述,这些结果表明衣康酸抑制了过度炎症,促进了细菌的持续存在,并使宿主能够耐受这种感染。

6 MKP103上调T6SS以响应氧化剂应激

由于宿主上调Irg1表达以对抗炎症,细菌病原体也在适应局部微环境。

①从WT小鼠、Irg1-/-小鼠的肺中收集MKP103,和体外LB培养的MKP103一起,进行转录组测序,上调基因包括抗氧化应激(GSH介导的ROS解毒和铁载体产生)和响应氧化剂诱导的DNA损伤修复基因(文献支撑,Ezraty et al.,2017; Kertesz,2000; Li et al.,2018; Peralta et al.,2016)。另外,和体外LB相比,体内感染的细菌中观察到T6SS基因表达增加,尽管部分FDR较大(虚线以上为FDR<0.05)。


②在体外存在氧化剂应激(H2O2)的情况下,观察到通过肠杆菌素再循环和水解介导铁螯合的entS、fepA/D/G和fes的表达增加,这与肠杆菌素的抗氧化作用一致。在用抗氧化剂N-乙酰半胱氨酸(NAC)处理小鼠后,相关基因表达水平恢复。

图 S5-I/J 氧化剂应激处理和抗氧化剂处理后细菌相关基因的表达
图 S5-I/J 氧化剂应激处理和抗氧化剂处理后细菌相关基因的表达

③T6SS主要因其杀死细菌竞争对手的功能而为人所知(Basler et al., 2013),但它也以非接触方式感知和响应氧化剂应激(Liaw et al., 2019; Si et al., 2017a, 2017b; Wan et al., 2017)。在MKP103亲本菌株KPNIH1中确定了两个不同的T6SS基因座。体外观察到响应H2O2的T6SS基因表达的剂量依赖性增加。

与液体培养物相比,从小鼠肺收集的细菌中T6SS基因表达增加,证实了细菌在体内对氧化剂应激的反应,在用NAC处理小鼠后,T6SS基因表达显著降低。Irg1-/-小鼠中T6SS基因表达上调,也与T6SS在细菌感知过度炎症期间遇到的过度氧化应激中的作用一致。


④为了证实Kp T6SS在体内的重要性,作者检测了缺乏T6SS功能活性的MKP103突变体(DtssM-2)感染WT小鼠和Irg-/-小鼠的能力。DtssM-2突变体感染WT小鼠的能力没有受损,但感染Irg-/-小鼠的能力大大降低,这符合T6SS在Irg1微环境中存活的要求。

7 世界范围内Kp ST258中包括tssM-2在内的T6SS基因的保守性

为了更好地理解T6SS在Kp ST258感染的整体发病机制中的重要性,作者调查了公共可用的和地理上不同的Kp ST258分离株中T6SS基因的保守性,基因组数据库大多是院内感染的数据。所有选择的T6SS标记基因。存在于绝大部分临床分离株中,尤其来自肺部感染的Kp ST258分离株都保守含有T6SS标记基因。

五、讨论

与高致病性KPPR1菌株或纯化的LPS相比,KP ST258刺激独特的宿主代谢谱。这种代谢反应促进了宿主对Kp ST258感染的耐受性。疾病耐受性是一种固有的宿主反应,旨在限制病原体诱导的组织损伤,然而又被各种病原体利用得以在宿主中持续存在。


与Kp ST258感染相关的代谢应激导致了局部葡萄糖的消耗,这驱动宿主脂肪酸-β-氧化和谷氨酰胺分解,即通过氧化磷酸化(OXPHOS)产生ROS的途径,创造一个支持巨噬细胞极化的环境,使其具有更高的M2:M1比率和髓源抑制性单核细胞的积累。与成熟的中性粒细胞和单核细胞不同,这些细胞不积极参与细菌清除,反而产生衣康酸,进一步限制炎症。


MDSCs由于缺乏独特的表面或细胞内标记而难以准确识别,通常出现在氧化应激倾向的微环境中,如肿瘤中,并抑制免疫效应细胞的激活,从而促进肿瘤生长。本研究表明,呼吸道中代谢活跃的Kp ST258以类似增殖肿瘤细胞的方式,诱导代谢应激并促进免疫抑制的MDSCs和M2巨噬细胞。因此,代谢环境和累积的MDSCs足以抵消LPS诱导的促炎反应,使惰性感染成为可能。


线粒体氧化磷酸化诱导的活性氧对病原体和宿主一样具有破坏性。Kp ST258通过上调T6SS基因来适应这种充满氧化剂的环境,尽管具体机制仍有待确定。虽然改变代谢组以提升促炎单核细胞反应,可能会导致局部破坏性炎症,但也有可能改变呼吸道代谢组以防止细菌适应内环境,并增强细菌的清除。

分类:

其他

标签:

医学

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