jamesbang

V1

2022/11/10阅读:31主题:雁栖湖

🤑 qPCRtools | 神仙R包分分钟搞定你的qPCR实验结果!~

1写在前面

不知道大家都是怎么完成qPCR的计算的,在不会R的时候,我是用一个祖传Excel表进行计算的。🤣
但是,一直有个缺点,如果需要计算的量比较大时,就不方便了,去搜了一下文献,发现了一个最近发表的R包,不仅可以计算反转录RNA体积,还可以帮助选择定量方法,简直是神仙R包,本期就介绍一下它的使用吧。🥰
感谢原作者的开发,嘿嘿,文末有引用方法。👀

2用到的包

rm(list = ls())
library(tidyverse)
library(ggsci)
library(qPCRtools)
library(ggstatsplot)

3计算反转录用的RNA体积

3.1 示例数据

包内自带了示例数据,这里我们就直接加载吧。🥳
df.1需要至少2列sampleconcentration,剩下的大家随意。🤣
Note! 这里浓度默认是ng/ul。🤜

df.1.path <- system.file("examples", "crtv.data.txt", package = "qPCRtools")

df.1 <- data.table::fread(df.1.path)

head(df.1)

Note! 这里我们的df.2文件至少要包含一个all的列,告诉R具体的反应体积。🤒

df.2.path <- system.file("examples", "crtv.template.txt", package = "qPCRtools")

df.2 <- data.table::fread(df.2.path)

head(df.2)

3.2 开始计算

现在我们就知道每个sample该如何配置反转路体积啦,Perfect!😁
这里我们假设反转1ug。🤩

result <- CalRTable(data = df.1, template = df.2, RNA.weight = 1)

head(result)

4相对标准曲线和扩增效率的计算

拿到新的Primers应该先进行扩增效率的计算,一起看下怎么弄吧。👇

4.1 示例数据

df.1包含至少2列,孔的位置Cq值。😗

df.1.path <- system.file("examples", "calsc.cq.txt", package = "qPCRtools")

df.1 <- data.table::fread(df.1.path)

head(df.1)

df.2包含至少2列,孔的位置浓度。🫠

df.2.path <- system.file("examples", "calsc.info.txt", package = "qPCRtools")

df.2 <- data.table::fread(df.2.path)

head(df.2)

4.2 开始计算

Note! 大家注意一下这里的稀释倍数,默认是4,可以按需更改。😂

CalCurve(
cq.table = df.1,
concen.table = df.2,
lowest.concen = 4,
highest.concen = 4096,
dilu = 4,
by = "mean"
) -> p

p[["table"]]

4.3 可视化

p[["figure"]] +
theme_bw()+
scale_color_npg()

5使用相对标准曲线法计算基因表达水平

如果内参基因目的基因扩增效率不相等,我们就不能使用2-ΔΔCt法了,需要选择无参的方法。🤨

5.1 示例数据

cq.table至少包含positionCq值。😘

df1.path <-  system.file("examples", "cal.exp.curve.cq.txt", package = "qPCRtools")

cq.table <- data.table::fread(df1.path)

head(cq.table)

curve.table标准曲线,可以通过前面介绍的方法计算得出。😂

df2.path = system.file("examples", "cal.expre.curve.sdc.txt", package = "qPCRtools")

curve.table = data.table::fread(df2.path)

head(curve.table)

design.table需要包含position和相应的信息,如干预基因名等。 🙃

df3.path = system.file("examples", "cal.exp.curve.design.txt", package = "qPCRtools")

design.table = data.table::fread(df3.path)

head(design.table)

5.2 开始计算

CalExpCurve(
cq.table,
curve.table,
design.table,
correction = TRUE,
ref.gene = "OsUBQ",
stat.method = "t.test",
ref.group = "CK",
fig.type = "box",
fig.ncol = NULL) -> res

res[["table"]]

5.3 可视化

大家可以直接使用res[["figure"]]提取结果的可视化图,这里我为了更加美观,提取了数据进行美化。😘

res[["table"]] %>% 
grouped_ggbetweenstats(y = expre,
x = Treatment,
grouping.var = Gene,
type = "nonparametric"
)

62-ΔΔCt法计算表达水平

数据准备与上面的方法相似,这里就不做具体介绍了。😂

6.1 示例数据

df1.path <-  system.file("examples", "ddct.cq.txt", package = "qPCRtools")

cq.table <- data.table::fread(df1.path)

head(cq.table)

df2.path <-  system.file("examples", "ddct.design.txt", package = "qPCRtools")

design.table <- data.table::fread(df2.path)

head(df.2)

6.2 开始计算

CalExp2ddCt(cq.table,
design.table,
ref.gene = "OsUBQ", ## 内参
ref.group = "CK", ## 对照
stat.method = "t.test", ## 统计方法
fig.type = "bar",
fig.ncol = NULL) -> res

res[["table"]]

6.3 可视化

res[["table"]] %>% 
grouped_ggbetweenstats(y = expre,
x = Treatment,
grouping.var = gene,
type = "nonparametric"
)

7使用RqPCR方法计算表达水平

这种方法也是一种不需要内参的计算方法,数据格式也是几乎一样的。

7.1 示例数据

df1.path <- system.file("examples", "cal.expre.rqpcr.cq.txt", package = "qPCRtools")

cq.table <- data.table::fread(df1.path, header = TRUE)

head(cq.table)

df2.path <- system.file("examples", "cal.expre.rqpcr.design.txt", package = "qPCRtools")

design.table <- data.table::fread(df2.path, header = TRUE)

head(design.table)

7.2 开始计算

CalExpRqPCR(cq.table,
design.table,
ref.gene = NULL,
ref.group = "CK",
stat.method = "t.test",
fig.type = "box",
fig.ncol = NULL
) -> res


res[["table"]]

7.3 可视化

res[["table"]] %>% 
grouped_ggbetweenstats(y = Expre4Stat,
x = group,
grouping.var = gene,
type = "nonparametric"
)

8引用

🌟 如何引用:👇

Li X, Wang Y, Li J, Mei X, Liu Y, Huang H. qPCRtools: An R package for qPCR data processing and visualization. Front Genet. 2022;13:1002704. Published 2022 Sep 13. doi:10.3389/fgene.2022.1002704


泡芙
最后祝大家早日不卷!~

点个在看吧各位~ ✐.ɴɪᴄᴇ ᴅᴀʏ 〰

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