留胡子的豆腐

V1

2022/02/01阅读:99主题:橙心

环2

争议|外源circRNA construct 到底是否会触发机体免疫反应?

前面提到Daniel G. Anderson构建外源CircRNA Construct用于真核细胞表达外源蛋白,但是,想要将体外构建的CircRNA导入人体细胞内,应用于疫苗或者抗体药物,面临的首要问题是:外源CircRNA Construct是否会触发人体的免疫反应?如果触发人体免疫反应,我们应该采取什么样的手段去避免机体对于外源CircRNA的免疫反应?今天,主要给读者大人采集整理这方面的信息。

细胞内外源核酸Sensors

首先,我们需要了解一点免疫学知识,天然免疫(innate immune system)是哺乳动物免疫系统抵抗病原微生物入侵的第一道防线,机体通过模式识别受体(pattern recognition receptors)来识别病原体相关的模式分子(pathogen-associated molecular pattern)。病原体相关的模式分子是病原微生物(细菌和病毒)所共有的一些结构保守的模式分子,比如蛋白,核酸,LPS等,一旦细胞内的模式识别受体结合,通过级联反应,可以激活机体的天然免疫反应,表达分泌I型干扰素,发挥抗病毒效应。细胞内的核酸感受器主要可以分为以下2种(PMID: 2821527):

  • DNA Sensors
    • cGAS-Sting(long double-stranded DNA or short forms of double-stranded DNA with single-stranded overhangs containing Gs )
    • TLR9 (single-stranded DNA containing unmethylated CpG dinucleotides)
    • AIM2 (long double-stranded DNA)
  • RNA Sensors:
    • TLR3 (long double-stranded RNA)
    • TLR7 (double-stranded and containing G and U)
    • TLR8 (single-stranded RNA)
    • RIG-I (at least a short double strand with a blunt end and a 50-triphosphate.)
    • MDA5 (double-stranded RNA)
细胞内外源核酸Sensors
细胞内外源核酸Sensors

线性mRNA刺激机体免疫反应

早在2005年的时候,Katalin Karikó就发现不同类型的RNA刺激诱发DC细胞免疫反应的程度是不同的,RNA修饰程度越高,DC细胞受到的免疫刺激越弱。相比于体外转录mRNA刺激DC细胞分泌的TNF-ɑ水平,Katalin发现哺乳动物细胞total RNA,细胞核RNA,细胞质RNA,mRNA-polyA tail 刺激DC细胞分泌的TNF-ɑ水平均在一个非常低的水平,两者差异非常显著。哺乳动物线粒体RNA(mitochondrial)和细菌total RNA强烈刺激DC细胞分泌的TNF-ɑ,这是由于哺乳动物线粒体RNA和细菌total RN在结构上有着更多的相似性——有着比较少的化学修饰。对于化学修饰较多的tRNA,不管是哺乳动物tRNA,还是细菌tRNA,相比较其他类型化学修饰较少的RNA,刺激DC细胞分泌的TNF-ɑ水平发生了显著下降。接着,Katalin利用修饰核苷酸(m5C, m6A, m5U, s2U, or pseudouridine)体外转录合成mRNA,转染能够稳定表达TLR受体的293细胞,通过检测细胞分泌的IL8水平来判断外源mRNA对于TLR的激活,试验数据表明,利用化学修饰核苷酸合成出来的mRNA能够避免被TLR受体识别,从而消除细胞免疫反应。Katalin此篇文章扫除外源mRNA导入人体细胞进行蛋白表达的一个关键性障碍,成为mRNA疫苗研发史上一个标志性事件(PMID: 16111635)。

修饰核苷酸消抑制细胞TLR识别外源RNA
修饰核苷酸消抑制细胞TLR识别外源RNA

外源circRNA触发机体免疫反应的争议

那么,外源circRNA construct 到底是否会触发机体免反应?针对这个问题,从2017年7月到2021年11月,四年多的时间里,三位观点不同的大佬在Molecular Cell发表了4篇文章来阐释这个问题。

在2017年Howard Y. Chang在Molecular Cel发表文章首次发现circRNA可以触发细胞天然免疫反应。

在2019年5月Daniel G. Anderson在Molecular Cel发表文章,拿到了非常漂亮的数据,提出完全相反的观点,宣称外源circRNA并不会触发机体天然免疫反应,并且指出Howard Y. Chang可能是在制备circRNA的时候,纯化没有做到位,混入了线性RNA,因此得出错误论。Daniel G这是杀人诛心啊,直接说你试验操作有问题。有意思的是,Daniel G基于此前circRNA构建和circRNA免疫反应的两篇文章,同年(2019年)申请了专利(WO2019236673A1)。

戏剧性的一幕发生了,仅仅过了五个月,Howard Y. Chan紧随其后,同样在Molecular Cel发表文章,对Daniel G质疑样品制备有问题毫不客气地回怼,指出Daniel G circRNA样品纯化处理还没有自己做的细致严谨。既然Daniel G说混入了5' triphosphorylated linear RNA ,那好为了消除他的猜忌,Howard Y. Chan这篇文章所有的circRNA完成环化以后全部用phosphatase 处理,从circRNA样品中彻底移除掉 linear 5'phosphorylated RNAs ,试验结果依旧证明circRNA可以触发细胞天然免疫反应,并且有了新的发现,未经修饰的circRNA可以作为非常好的佐剂来触发机体产生抗原特异性的T and B cell response,只有经过化学修饰的N6-methyladenosine (m6A) circRNA才可以抑制机体的天然免疫反应。

两年以后,中科院生化细胞所陈玲玲也加入了这场论战,你们吵来吵去的,干脆我来做一遍。陈琳琳发现,不同方式构建的circRNA会触发不同程度的免疫反应,采用 group I introns 构建的circRNA会触发机体免疫反应,而通过T4 RNA ligase构建的cicRNA对细胞免疫反应的刺激非常弱。吊诡的是,2017年Howard Y. Chang的文章中就测试过T4 RNA ligase构建的cicRNA,试验数据却展示T4 RNA ligase构建的cicRNA很强烈地触发了细胞天然免疫反应。

到这里,相信大家也糊涂了,大佬们自说自话,数据一个比一个漂亮,却相互对应不起来。综合起来看,笔者更偏向于不管采用何种方式构建cicRNA,应该都会触发细胞天然免疫反应,由于采用不同的细胞系,造成观察到的数据可能有偏差。

那么,就让我们详细看看三位大佬发表的4篇文章,看看是否能够找到一些解开这个难题的蛛丝马迹。

2017-Howard Y. Chang——circRNA可以触发细胞天然免疫反应

在2017年,Howard Y. Chang在Molecular Cell发表文章Sensing Self and Foreign Circular RNAs by Intron Identity,他分析试验数据,得出以下结论-:

  • 外源circRNA 能够强烈触发细胞的免疫信号

  • 被外源circRNA转染的细胞抗病毒能力增强

  • 细胞通过内含子序列来区分自身circRNA和外源circRNA

  • 成熟的人源circRNA经常和不同的RNA-Binding蛋白结合,将其标记为自身circRNA

  1. Howard Y. Chang circRNA环化方法:

    通过The group I intron of phage T4 thymidylate synthase (td) gene 来构建外源circRNA,由CMV IRES来启动GFP蛋白的翻译表达。通过qPCR的方法来评估成环效率,divergent primers可以检测circRNA,convergent primers可以检测circRNA和linear RNA。

  2. Howard Y. Chang circRNA纯化方法:

    环化反应完成后,用RNase R处理消除线性片段,用phosphatase 处理消除5'phosphates 。

    Howard Y. Chang circRNA制备纯化方法
    Howard Y. Chang circRNA制备纯化方法
  3. 外源circRNA可以刺激细胞天然免疫相关基因的表达

    Howard Y. Chang构建外源circRNA本来也是想作为外源蛋白表达的载体,但是奇怪的是,他用外源circRNA转染HeLa cells后,细胞内GFP蛋白表达量很低,并且没有展示相关数据。比较他跟2018年Daniel G发表在NC上的文章可以发现,Howard Y. Chang构建的外源circRNA序列中似乎没有放入两个exon序列,并且GFP序列和IRES序列前后顺序也有差异。意外的是,Howard Y. Chang发现了外源circRNA具有非常强烈的免疫刺激效应,并且证实RIG-I是外源circRNA的胞内Sensors。

     RIG-I Is Necessary and Sufficient to Sense Exogenous CircRNA
    RIG-I Is Necessary and Sufficient to Sense Exogenous CircRNA
  4. 排除circRNA制备过程存在的副产物污染引起天然免疫的猜测

    由于已知的RIG-I的配体是含有5' triphosphate的RNA,因此Howard Y. Chang用phosphatases 处理circRNA,消除掉可能存在的末端5' triphosphate,结果发现用phosphatases 处理过的circRNA依然可以触发细胞天然免疫反应。接着,又测序证实构建的circRNA并不含有非常长的双链互补区域(long dsRNA duplex)。然后发现,通过连接酶方式产生的circRNA也会触发细胞天然免疫反应。最后,用RNase H 线性化处理circRNA,能够消除免疫刺激效应,彻底证实细胞天然免疫反应确实是由circRNA引起的,而不是环化反应中存在的其他副产物造成的。

2019-Daniel G. Anderson-cicrRNA不会引起细胞天然免疫反应

2019年5月,Daniel G. Anderson在Molecular Cell发表文章RNA Circularization Diminishes Immunogenicity and Can Extend Translation Duration In Vivo,针对cricRNA免疫反应性和体内蛋白表达,得出以下结论:

  • 环化反应过程产生的Triphosphorylated and linear RNA contaminants触发细胞的天然免疫反应

  • 纯化的circRNA不会触发RIG-I介导的天然免疫反应

  • 纯化的circRNA不会触发TLR介导的天然免疫反应

  • LNP包裹的circRNA可以在小鼠组织内表达外源蛋白

  1. Daniel G. Anderson circRNA环化方法

    Daniel G. Anderson采用优化的基于the permuted Anabaena pre-tRNA group I intron的circRNA构建方法,组成circRNA precursors 序列的元件包括:CVB3 IRES;GLuc CDS序列;spacer sequences;同源序列;exon序列。可以看到Daniel G. Anderson构建的circRNA序列组成要比Howard Y. Chang更加复杂。

  2. Daniel G. Anderson circRNA纯化方法

    为了确保circRNA的纯度,Daniel G. Anderson在完成环化反应以后,对环化反应的产物进行了一系列连续处理,RNase R富集circRNA,HPLC移除非环化组分,phosphatase移除残留的末端triphosphates 。然后,将纯化后的circRNA转染细胞,检测细胞因子的分泌。由于在293细胞中不含由几个关键的RNA sensors,因此没有检测到细胞因子的分泌。但是,在A549细胞中,发现随着纯化方法的不断提升,cicrRNA引起的免疫反应逐渐减少消失,说明cicrRNA纯度是造成细胞天然免疫反应的关键因素。

  3. 分析环化反应的各组分对于细胞天然免疫反应的影响

    环化反应的各组分主要包括:高分子量组分(linear and circular concatenations),circRNA(为防止同nickedRNA峰的重叠,收集组分了early circRNA和late circRNA),nicked RNA,precursor RNA,Introns。

    通过HPLC分离环化反应的各组分
    通过HPLC分离环化反应的各组分

    为了找到环化反应产物中究竟是哪些组分引起细胞天然免疫反应,Daniel G. Anderson用HPLC分离环化反应产物中的各组分,转染A549细胞,检测细胞因子分泌水平。结果发现,late circRNA 不会触发细胞免疫反应,但是early circRNA由于混入了少量linear RNA,触发了明显的细胞免疫反应。在A549细胞中,与late circRNA 相比,未经纯化的环化反应产物,线性化的precursor RNA(剪切位点突变的△Splice Sites)会刺激RIG-I基因和IFNβ基因的表达上调,由此得出 circRNA并不是RGI-I的天然配体,这与2017年Howard Y. Chang得到的结论完全是相反的。

    细胞天然免疫反应是由环化反应中的其他组分引起的
    细胞天然免疫反应是由环化反应中的其他组分引起的

    Daniel G. Anderson用RNaseR处理环化反应产物,转染A549细胞后,与late circRNA相比,并不能消除细胞免疫反应,说明RNaseR处理环化反应产物无法消除全部的线性RNA,可能有残留。

  4. 修饰核苷酸对circRNA免疫刺激反应和蛋白翻译的影响

    将circRNA中的尿嘧啶全部用N1-Methylpseudouridine替换,会抑制I型Introns的剪切活性,阻断环化反应的发生。如果采用连接酶的方式来构建circRNA,那么此种替换,不会影响环化反应的发生。把未经修饰的circRNA和N1-Methylpseudouridine修饰的circRNA转染细胞,结果发现N1-Methylpseudouridine修饰的circRNA居然丧失蛋白翻译表达能力。未经修饰的线性mRNA,尽管经过加帽,加尾巴,phosphatase处理,HPLC纯化,移除RIG-I配体,但是同未经修饰的circRNA相比,依然会刺激细胞产生强烈的免疫反应。

     circRNA转染293细胞和A549细胞,检测Gluc表达水平和各自细胞因子表达水平
    circRNA转染293细胞和A549细胞,检测Gluc表达水平和各自细胞因子表达水平

    此外,Daniel G. Anderson还研究了m6A对于circRNA蛋白翻译表达的影响,构建GLuc-coding circ△IRES(去除掉IRES,起始密码子上游区域为富含A的序列),结果发现,与未经修饰的circRNA相比,m6A-circRNA蛋白翻译表达能力居然发生了下降,m6A- circ△IRES基本上检测不到表达蛋白的活性。这些数据说明,不管是从蛋白表达效率还是刺激细胞引发免疫反应来说,外源circRNA似乎并不能从修饰核苷酸获得更好的性能提升。

    circRNAs转染293细胞,检测Gluc表达水平
    circRNAs转染293细胞,检测Gluc表达水平
  5. circRNA可以逃脱TLR识别

    Daniel G. Anderson研究了不同类型的RNAs对TLR的激活。所有的线性RNAs(capped-mRNA,polyadenylated mRNA,N1-Methylpseudouridine-mRNA),用phosphatase处理,HPLC纯化。结果发现,线性RNAs和circRNAs无法激活TLR7,但是capped linearized RNA, polyadenylated linearized RNA, the nicked circRNA , the early circRNA 可以激活TLR3和TLR8,只有The late circRNA 和N1-Methylpseudouridine-mRNA在任何类型细胞中都不能触发TLR-mediated response。这就说明,只要circRNA足够纯,不混入其他的杂质,可以避免被细胞内的TLR识别。

    各自类型的RNAs转染TLR Report cells,检测SEAP表达水平
    各自类型的RNAs转染TLR Report cells,检测SEAP表达水平
  6. 外源circRNA在小鼠体内的蛋白表达能力和免疫原性

    Daniel G. Anderson把circRNA导入小鼠体内,发表circRNA在小鼠体内蛋白表达能力是优于N1-Methylpseudouridine-mRNA的,而且也不会触发免疫反应。

    把circRNA和线性mRNA导入小鼠体内,检测血清当中hEpo表达水平,检测血清当中各自细胞因子表达水平变化。
    把circRNA和线性mRNA导入小鼠体内,检测血清当中hEpo表达水平,检测血清当中各自细胞因子表达水平变化。

2019-Howard Y. Chang-m6A化学修饰调控circRNA免疫原性

2019年10月,Howard Y. Chang又在Molecular Cell发表文章N6-Methyladenosine Modification Controls Circular RNA Immunity,得到与Daniel G. Anderson相反的观点,继续坚定地认为circRNA就是可以触发免疫反应:

  • 未经修饰的circRNA可以作为一种佐剂,触发抗原特异性的T细胞和B细胞反应
  • m6A化学修饰将circRNA标记为自身circRNA,阻断circRNA免疫原性
  • 未经修饰的circRNA结合RIG-I and K63- Polyubiquitin Chain,启动天然免疫反应
  • YTHDF2结合m6A-circRNA,抑制circRNA免疫原性
  1. circRNA酶法纯化

    Howard Y. Chang首先阐述2017年文章中circRNA标准酶法纯化方法:环化反应完成以后,用RNase R处理2h以上,降解线性副产物,然后用alkaline phosphatase处理移除掉末端5'phosphate。他认为,相比较线性RNA用phosphatase处理可以降低细胞免疫反应,用标准方法纯化获得的circRNA接着用phosphatase再处理一遍,circRNA对于细胞的免疫刺激反应没有任何改善。因此,他认为circRNA对于细胞的免疫刺激反应与样本中存在异常的5'triphosphates无关。

    接着,他认为如果circRNA样本存在线性RNA组分,那么由于具有不同的分子量,因此通过胶回收可以去除这些线性组分。他比较了胶回收纯化的circRNA和标准酶法纯化的circRNA对于细胞的免疫刺激反应,结果发现两者没有区别。

    胶回收纯化和酶法纯化获得的circRNA刺激天然免疫相关基因的表达
    胶回收纯化和酶法纯化获得的circRNA刺激天然免疫相关基因的表达

    最后,Howard Y. Chang用HPLC分离RNaseR 处理的circRNA,有两个收集峰,这与Daniel G. Anderson获得的HPLC峰图是不相同的,Howard Y. Chang认为这种差别可能是由于不同仪器造成的。两个组分转染细胞后,都能够刺激细胞天然免疫相关基因的表达。

    Howard Y. Chang认为从circFOREIGN integrity的角度来看,酶法纯化>胶回收>HPLC,因此这篇文章还是采用标准的酶法纯化。与Daniel G. Anderson关于circRNA免疫原性结论的反差,Howard Y. Chang认为这可能是由于circRNA序列的差别,转染细胞的差别所引起的,跟纯化方法关系不大。

  2. circRNA可以作为疫苗佐剂和具有抗肿瘤效应

    Howard Y. Chang将CircFOREIGN(GFP cricRNA)和OVA通过皮下注射打入小鼠体内,结果发现CircFOREIGN可以强有力地诱导OVA-specific CD8+ T cells和OVA-specific antibodies生成。无须转染试剂,裸CircFOREIGN就可以实现此种效果。

    使用OVA抗原和CircFOREIGN接种小鼠,可以减少OVA-expressing tumors的形成,因为CircFOREIGN诱导生成的OVA-specific CD8+ T cells可以限制OVA-B16 melanoma 模型的建立。这些数据说明CircFOREIGN的免疫原性可以用于临床治疗。

  3. 机体通过m6A化学修饰区分self-circRNA和CircFOREIGN

    哺乳动物细胞内也存在很多内源性的circRNA,机体对于CircFOREIGN免疫反应性,说明机体可以区分内源性的circRNA和外源性的circRNA。这种区分机制很可能依靠的是化学修饰,m6A是最丰富的RNA化学修饰,因此他测定了与内源性circRNA和外源性circRNA结合的m6A相关的蛋白分布情况,结果发现内源性circRNA经常和m6A writer complex 和 reader proteins 结合在一起。这里的CircFOREIGN是指通过体外环化反应生成的circRNA,编码区是GFP序列,CircSELF是指利用ZKSCAN1 introns 来完成环化,导入细胞内的是质粒,然后再细胞内相关蛋白的辅助下完成环化反应。

  4. m6A化学修饰可以减弱circRNA免疫原性

    通过控制体外转录反应中加入的m6A比例,可以生成含有不同m6A比例的CircFOREIGN,转染细胞,结果发现,CircFOREIGN可以强烈地刺激一系列抗病毒基因的表达,1% m6A-CircFOREIGN可以非常显著地减少抗病基因地诱导,充足的m6A修饰可以为完全消除细胞天然免疫反应的诱导。在小鼠体内,1% m6A-CircFOREIGN可以显著地减少对于CD8 T cell response和特异性抗体的产生,说明1% m6A 化学修饰足以消除CircFOREIGN的免疫原性。

  5. YTHDF2识别m6A-marked circRNAs,消除细胞天然免疫反应

    如果在细胞中敲除m6A reader protein(YTHDF2 because),则会消除m6A化学修饰对于circRNA抗病毒基因激活表达的抑制作用。如果在YTHDF2 KO 细胞中,表达YTHDF2蛋白,则会恢复m6A化学修饰对于circRNA抗病毒基因激活表达的抑制作用。说明YTHDF2对于细胞将m6A-marked circRNAs识别为自身circRNA是必不可少的。

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  6. RIG-I识别circRNA的方式不同于线性RNA配体

    当RIG识别5'-triphosphate dsRNA,RIG蛋白helicase domain会水解ATP,但是当RIG-I和circFOREIGN或者5'hydroxyl linear RNA孵育时,并不能够触发ATPase activity,说明circFOREIGN和RIG-I的相互作用不同于5'-triphosphate dsRNA。

  7. circRNA通过RIG-I启动天然免疫反应

    未经修饰的circRNA和m6A -circRNA都可以结合RIG-I,但是只有未经修饰的circRNA可以启动MAVS丝状体聚集,从而导致IRF3二聚化,干扰素的形成。m6A -circRNA可以被YTHDF2结合,都是无法激活RIG-I,启动天然免疫反应信号。

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Ling Ling Chen-2021-RNA circles with minimized immunogenicity as potent PKR inhibitors

2021年,陈玲玲在在Molecular Cell发表文章RNA circles with minimized immunogenicity as potent PKR inhibitors,利用三种不同的环化方法,得出以下结论:

  • 利用T4 RNA ligase形成的circRNA,免疫原性最弱。
  • 利用group I introns形成circRNA,引入的额外序列会触发免疫反应
  • 不引入额外序列的circRNA中存在的短dsRNA能够作为PKR抑制剂
  1. 陈玲玲circRNA纯化方法和免疫原性

    1. 陈玲玲采用的circRNA纯化方法是先切胶回收,然后再用RNase R处理45min。通过测序发现,利用group I introns形成circRNA,会在剪切位点引入74bp或者184bp额外的核苷酸序列。通过不同环化方式产生的circRNA触发不同程度的免疫反应性,通过连接酶形成的circRNA引发的免疫反应最小,通过group I introns形成circRNA触发的免疫反应程度和dephosphorylated linear RNAs触发的相当。

  2. 不同环化策略形成的circRNA与PKR的相互作用是不同的

    陈玲玲发现,不同的环化策略形成的circRNA空间构象是不相同的。PKR是干扰素诱导的Ser/Thr protein kinase,可以被long dsRNA A (>33 bp, with 79 bp achieving maximal activation)激活,但是长度在16–33 bp的short dsRNA会阻断PKR的活性。利用连接酶形成的circRNA能够抑制PKR活性,利用group I introns形成的circRNA能够激活PKR强度高于33bp dsRNA,弱于79bp dsRNA。

    总结

    由于采用的环化策略不同,circRNA序列不同,纯化方法不同,转染细胞不同,造成circleRNA触发细胞免疫反应程度出现巨大差异。我们可以看到,Daniel G是致力于将circRNA作为一种外源蛋白表达的载体,其构建的circRNA不会再小鼠体内触发免疫反应,可以应用于疫苗或者抗体药物。;Howard Y. Chan没能实现circRNA表达外源蛋白,意外发现自己构建的circRNA具有免疫原性,并且验证在小鼠体内可以作为一种疫苗佐剂,触发抗原特异性的细胞免疫反应;陈玲玲比较了三种不同的环化策略,发现不同的环化策略产生不同构象和序列的circRNA,并且发现利用连接酶产生的circRNA可以作为PKR抑制剂。未来,可能需要更多的研发人员去更加精细地寻找这些circRNA构建策略所导致的巨大免疫反应差异的根本原因,从而根据需要将其应用于不同的场景。

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后端

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