留胡子的豆腐

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2022/04/10阅读:17主题:红绯

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回溯|N1-甲基-甲尿嘧啶破除Moderna公司前进障碍

凝聚
凝聚

多年以后,面对Moderna公司的千亿市值,Jason Schrum一定会回想起自己忍着关节疼痛(退行性关节炎),独自在阴暗的地下室反筛选修饰核苷酸,终成利器的那个遥远下午。尽管从原创新的角度来看,Schrum的发现无法和Karikó相提并论,但是正是因为他在2011年3月的发现—N1-甲基-甲尿嘧啶可以消除体外合成mRNA的免疫原性,提升翻译效率,才使得Moderna公司另辟蹊径,绕开宾夕法尼亚大学假尿嘧啶化学修饰mRNA的专利限制,在mRNA技术产业化道路上,无所牵制地快速迈进。

独具慧眼

2010年,波士顿儿童医学院的干细胞生物学家Derrick Rossi成功利用体外合成的mRNA,过表达4种经典的Yamanaka因子,编程已经分化的人细胞,成功将其转变为诱导性多能干细胞(iPSC)。以同样的mRNA技术,还能将重编程后的诱导性多能干细胞定向重新分化形成终末分化的肌原细胞(myogeic cell)。要通过mRNA技术实现细胞重编程,必须要克服2个难题。首先,mRNA很容易在细胞内降解,无法达到编码因子需要持续表达2周的要求。Rossi及其博后Warren仔细检查mRNA转染细胞后,重编程因子表达水平的动力学后,得出结论,需要进行每日转染以维系重编码因子的表达水平。这就带来一个非常关键的问题,如何才能避免外源mRNA引发的抗病毒效应。他们在体外合成mRNA时,用假尿嘧啶替换尿嘧啶,甲基胞嘧啶替换胞嘧啶,极大地消除了免疫原性,实现外源蛋白高效地表达。通过化学修饰,巧妙地给体外合成的mRNA披上小马甲,使其更像是细胞内源性生成的mRNA,从而避免刺激天然免疫系统,引发炎症反应。

Rossi及其博后Warren将这项代表着再生医学重大进步的研发成果发表在Cell stem cell—Highly efficient reprogramming to pluripotency and directed differentiation of human cells using synthetic modified mRNA,这项研究引起了Robert Langer和Afeyan极大的关注,两外大佬从中窥见到实现免疫逃脱以后的修饰mRNA所蕴藏的颠覆性力量。在2010年的九月,Rossi和Langer一起拉上当时在哈佛医学院的心血管生物学家Kenneth Chien,三人一起共同成立Moderna公司。Moderna,这个名字还是源自Rossi的想法—"modify and RNA"的简写。非常好玩的是,Moderna现任董事会里面已经找不到Rossi和Kenneth Chien,Langer和Afeyan作为共同创始人依然位列其中。

拨云见日

尽管Rossi及其博后Warren用mRNA技术成功实现细胞重编程,但是,他们用修饰mRNA降低免疫原性的想法是源自宾夕法尼亚大学的Katalin Karikó 和Drew Weissman 的研究成果。

为了实现自己坚守多年的信念-用体外合成的mRNA在人体内制造出各种所需要的蛋白,Katalin 飘洋过海,只身来到美国。几经辗转,一次在复印机面前的偶遇,让她进入Drew Weissman的实验室。她告诉Weissman,我是一个RNA科学家——我可以用mRNA制造出任何东西。尽管Katalin夸下海口,但是她的研究停滞不前。外源mRNA进入细胞后会触发天然免疫反应,刺激细胞释放各种细胞因子,造成炎症反应。如何让外源mRNA完美躲避细胞内天然免疫系统的识别,成为Katalin必须翻越的大山。

有研究证实TLR3可以感应外源的Poly(I)Poly(C)dsRNA,从而触发天然免疫信号,但是无法识别PolyC同聚物ssRNA。尽管mRNA是单链结构,但是它跟PolyC同聚物还是不相同的,mRNA内部存在很多局部的双链区域。因此Katalin就想知道外源mRNA是否可以通过细胞内的TLR3来传递天然免疫信号,结果她发现DC细胞内的模式识别受体TLR3可以识别体外合成的mRNA,激活天然免疫信号,释放各种细胞因子[1]。

阻断TLR3信号通路会抑制mRNA诱导的DC细胞成熟或者瞬时表达TLR3的HEK293细胞分泌IFN-β。
A图DC细胞与TLR3抗体孵育后,再进行一系列免疫刺激;B图HEK293细胞转染转染TLR3,同时再转染一个表达TRIF的质粒(dominant negative,用来阻断TLR3信号通路)或者对照质粒。
阻断TLR3信号通路会抑制mRNA诱导的DC细胞成熟或者瞬时表达TLR3的HEK293细胞分泌IFN-β。 A图DC细胞与TLR3抗体孵育后,再进行一系列免疫刺激;B图HEK293细胞转染转染TLR3,同时再转染一个表达TRIF的质粒(dominant negative,用来阻断TLR3信号通路)或者对照质粒。
缺乏或者短的3'PolyA尾巴的mRNA诱导DC细胞分泌DC细胞分泌IL-12
缺乏或者短的3'PolyA尾巴的mRNA诱导DC细胞分泌DC细胞分泌IL-12

在2005年,Katalin 在Imuunity发表文章Suppression of RNA Recognition by Toll-like Receptors: The Impact of Nucleoside Modification and the Evolutionary Origin of RNA,首次发现修饰核苷酸可以减弱天然免疫反应。他们首先发现真核细胞中不同类型的天然RNA具有不同的免疫刺激性。哺乳动物tRNA不会刺激DC细胞分泌TNF-α,但是线粒体RNA对DC细胞的免疫刺激活性是最强的。这并不令人感到意外,因为线粒体RNA跟细菌RNA具有更多的共同特征,而细菌的Total RNA恰恰对DC细胞来说是一个很强烈的免疫刺激因子。与此相反的是,细菌的tRNA诱导DC细胞分泌的TNF-α水平很低。这说明不同类型的天然RNA拥有不同的免疫刺激活性,而且跟核苷酸修饰程度呈现负相关性,因为核苷酸修饰程度最少的细菌total RNA和线粒体RNA对于DC细胞来说是免疫刺激活性最强的激活因子,而化学修饰程度极高的tRNA基本上没有免疫刺激活性。

天然RNA刺激DC细胞分泌TNF-α
天然RNA刺激DC细胞分泌TNF-α

既然核苷酸的修饰会影响RNA对DC细胞的免疫刺激活性,那么接下来Katalin直接在IVT反应过程中,加入各种类型的修饰核苷酸,结果发现携带修饰核苷酸的外源合成mRNA会极大减弱对DC细胞的活化和细胞因子的分泌,而且这种对于天然免疫信号的抑制和mRNA携带的修饰核苷酸的数量是成正比例的。走到这里,曙光已现,下一步必然是用携带修饰核苷酸的mRNA在机体内表达外源蛋白,看看是否能逃脱天然免疫系统的识别,表达出真正有活性的蛋白。

修饰核苷酸抑制DC细胞分泌细胞因子
修饰核苷酸抑制DC细胞分泌细胞因子

2008年,Katalin 在体外合成mRNA的时候,用一系列修饰核苷酸去替换掉与其对应的基础核苷酸,分别生成携带不同类型的修饰核苷酸mRNA。测定这些修饰核苷酸在人体细胞中的蛋白表达情况,发现含有假尿嘧啶的mRNA具有最高的翻译效率,而且这种翻译效率的提升,同假尿嘧啶修饰的mRNA可以阻断RIG介导的天然免疫信号无关。最后,把编码荧光素酶的假尿嘧啶修饰核苷酸注射到小鼠体内,注射后24h内,可以在脾脏中检测到荧光光素酶的大量表达。更加重要的是,收集小鼠血清,发现与未经修饰的mRNA相比,假尿嘧啶修饰核苷酸,即便在较高注射剂量的情况,也不具有免疫原性。这项研究表明在机体注射修含有饰核苷酸的mRNA不仅可以提升mRNA稳定性和蛋白表表达效率,而且可以去除免疫原性[3]。假尿嘧啶修饰的mRNA标志着mRNA作为一种治疗性平台技术已经初具雏形,但是,令人遗憾的是,Katalin为此做出的一系列成果并未受到任何关注。

在小鼠体内,与未经修饰的mRNA相比,假尿嘧啶修饰的mRNA不具有免疫原性,拥有更高的蛋白表达效率。
在小鼠体内,与未经修饰的mRNA相比,假尿嘧啶修饰的mRNA不具有免疫原性,拥有更高的蛋白表达效率。

2010年,Rossi及其博后Warren利用mRNA技术实现细胞重编程,才使得大家意识到mRNA技术的无限潜力。Katalin专门给Warren致信,,感谢正直的Warren让他们的修饰mRNA变得众所周知,并且在NIH的讲座中专门提到他们在宾夕法尼亚大学一直以来所做的努力。酒香也怕巷子深,搞研究也得善于制造爆点,吸引流量。

Katalin写给Warren的感谢信
Katalin写给Warren的感谢信

背水一战

在2005年的时候,Karikó 和Weissman就开始提交尿嘧啶修饰核苷酸mRNA用于治疗性目的的专利申请,并且创办RNARx,进行mRNA治疗方面的研发。后来,由于两人同宾夕法尼亚大学在专利授权上面的争论,RNARx没能继续下走去。宾夕法尼亚大学转手将假尿嘧啶修饰核苷酸的专利授权给Cellscript,这家公司销售含有修饰核苷酸的RNA体外转录试剂盒。

Karikó 和Weissman的专利给起步中的Moderna公司造成巨大的威胁。2010年来自Flagship的内部会议记录显示:如果科学家不能够找到替代假尿嘧啶和5-甲基-胞嘧啶的方法,那么我们公司的技术可能要受限于从宾州大学获取授权专利。

Moderna需要找到一条可以绕开现有假尿嘧啶修饰核苷酸专利的路径,这个艰巨的任务落到第一个公司员工Jason Schrum身上。2010年,28岁的Schrum刚从哈佛医学院拿到生物化学的博士学位,在那里,他一直专注于核酸化学方面的研究。Afeyan 挑选了Schrum,告诉他,你需要找到Karikó专利的替代方法,Afeyan 租下另一家剑桥生物技术公司的地下室,用来给Schrum展开相关的研究工作。

Schrum从Cellscript买来RNA转录试剂盒,组合一系列的核苷酸修饰物,不断地尝试,很快他就感到巨大的压力。当时公司的投资人不相信Schrum能够成功,开始担心自己的投资从一开始就是注定失败的。Schrum顶着怀疑和来自关节的疼痛,在租来的地下室实验室里渡过2010秋季的每一天。在那里,大部分时间里,没有其他人来访,Schrum经常工作到深夜。有人说,在mRNA技术研发领域,没有人知道其他人做到什么程度,又有什么样的新发现,所有关于技术的信息都是死一般的寂静。

历经无数个夜晚,2011年三月,Schrum终于发现甲基甲尿嘧啶修饰核苷酸(1- methyl-pseudouridine)也可以欺骗细胞天然免疫系统。与Karikó发现的假尿嘧啶相比,含有甲基甲尿嘧啶修饰核苷酸的mRNA在体内蛋白表达效率更高,引起的炎症反应跟弱。2014年,美国专利商标局授予Moderna涵盖甲基甲尿嘧啶修饰核苷酸的多种修饰核苷酸专利。Schrum背水一战,帮助Moderna不仅绕开Karikó 和Weissman的假尿嘧啶专利,而且拿到甲基假尿嘧啶修饰核苷酸的专利。自从以后,Moderna在将mRNA技术变成一种治疗手段的道路上大步迈进。

总结

回顾这段修饰核苷酸的研究历史,Karikó数十年的坚守,Rossi以及Warren的助推,Schrum的幸运,还有递送技术的发展,所有人的努力才能将一个荒诞不经的想法变成可以实现的技术。mRNA技术的产业化,又离不开Robert Langer,Afeyan,Stéphane Bancel等人的推动。只有创新突破,才能缔造神话。但是,在mRNA技术领域,现在要想突破各种恼人的专利,已经是困难重重,基本上不太可能再有Schrum这样幸运的人。既然现有的结界无法突破,对于新型的mRNA公司来说,加快跑马圈地,开拓市场,显然是一条更加快速高效的成长方式。


1.mRNA Is an Endogenous Ligand for Toll-like Receptor

2.Cutting edge: innate immune system discriminates between RNA containing bacterial versus eukaryotic structural features that prime for high-level IL-12 secretion by dendritic cells

3.Incorporation of pseudouridine into mRNA yields superior nonimmunogenic vector with increased translational capacity and biological stability

细胞的天然免疫机制,在应对入侵者时,是如此的高效组织,齐心协力,分工明确。讽刺的是,由无数个它们堆积成的我们,在应对危机的时候,却是如此的混乱不堪,溃不成军。Katalin专门致信给

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