留胡子的豆腐

V1

2022/03/30阅读:75主题:红绯

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质粒发酵工艺的起源-DNA疫苗生产

要触发机体对于外源蛋白的免疫反应,常规做法是把体外表达的蛋白纯化出来,打入动物体内。然而,蛋白纯化的过程非常耗费时间,还会碰到许多困难。那能不能直接输入遗传信息,避开体外蛋白的表达纯化,有人做出大胆尝试。1992年,Tang DC等人利用生物弹道技术直接将编码人生长激素的基因(hGH)射入小鼠皮肤细胞中,在小鼠血清中检测到抗hGH抗体,成功触发免疫反应[1]。这个方法可以视为基因免疫(genetic immunization),是最早的DNA疫苗,自此以后针对肿瘤和病原体的DNA疫苗研发开始不断涌现出来。

与减毒疫苗相比,DNA疫苗有许多优势:相对安全;易于规模化生产;稳定;可冻存;可触发细胞免疫。同时,DNA疫苗在许多动物模型和早期临床试验中也被证明是安全有效的。在2021年8月,印度政府给ZyCov-D疫苗紧急授权,这是第一款新冠DNA疫苗。DNA疫苗多年积攒下来的研发经验为后来诸多技术的优化升级或者诞生做出巨大贡献,例如基因表达优化策略,mRNA结构设计,更加有效的递送系统,免疫佐剂等。其中最为重要的是,DNA疫苗的产业化前景直接导致治疗性质粒载体GMP级生产的需求,由此催生出大肠杆菌质粒发酵工艺,这也为后来mRNA疫苗产业化生产时模板的制备打下坚实的基础。

消除细菌质粒生产过程的弊端

DNA疫苗通常是基于可以编码抗原多肽的细菌质粒,这些质粒包含的元件有:抗原基因;质粒复制起始点,启动质粒复制;赋予细菌抗性的筛选基因,维系质粒在细菌中的持续存在。虽然通过细菌发酵的方式可以进行质粒规模化生产,但是,发酵过程中存在的诸多不可控风险和质粒序列上存在的抗性基因,使得获得高质量质粒载体成为限制DNA疫苗,mRNA疫苗,基因治疗产能的瓶颈。

宿主基因污染

这种依赖于细菌发酵的质粒生产方式可能发生小概率的发酵宿主菌基因组和治疗性质粒之间的基因重组事件。有人报道过在HPV治疗质粒临床生产过程中,发生一起意外的质粒污染事件,污染源来自携带有宿主菌Escherichia coli DH5基因组转座子(IS2-transposon)的质粒[4]。也就是说,发酵过程中,宿主菌基因组上的转座子插入到质粒上面了,而且这种污染只有在整个发酵工艺完成,进行质量分析才能发现。

来自宿主菌基因组上的转座子IS2插入治疗性质粒形成质粒发酵过程的污染源
来自宿主菌基因组上的转座子IS2插入治疗性质粒形成质粒发酵过程的污染源

移除治疗性质粒非必需元件

在培养大肠杆菌时,质粒上携带的抗性基因表达量非常高,甚至会形成包涵体,给宿主菌施加严重的代谢负担,对质粒的整体产量来说是有害的[3]。除了质粒DNA插入宿主基因组的风险,人们还担心存在于DNA疫苗质粒上面的抗性基因会水平转移(horizontal gene transfer)给宿主体内的病原体或者肠道菌群。因此,消除基因治疗质粒上上面非必要的多余序列,比如抗性基因或者复制起始点,不管是从安全的角度还是质粒发酵产量来说,都是非常有益的。

Antibiotic-Free Vectors

J A Williams成功开发出一种无抗生素的哺乳动物质粒表达载体(AF Vectors),以SacB作为反向筛选的标记。当宿主细胞内,不含AF质粒时,插入到染色体上的SacB基因表达蔗糖果聚糖酶( levansucrase),该酶能催化蔗糖水解成葡萄糖和果糖,并且将果糖聚合成高分子量的果聚糖。但高分子量果聚糖积累对细胞存在潜在的毒性作用, 可造成细胞死亡;当宿主细胞存在AF质粒时,该质粒可以表达150bp RNA-OUT 反义RNA,抑制SacB基因表达,从而来实现携带有AF质粒的宿主菌的筛选[2]。

AF反向筛选载体
AF反向筛选载体

Supercoiled minicircle

1997年,J Crouzet等人开发出一种新型的DNA递送载体,称为Supercoiled minicircle,这种迷你质粒上面只携带真核表达元件,不存在抗性基因和复制起始点。minicircle源自一个携带特异性重组位点(attB/attP)的大质粒,宿主细胞表达整合酶(Integrase),发生位点特异性重组,大质粒一分为二,一个携带表达元件的minicircle,一个携带抗性基因和复制起始位点(酶切去除)[5]。

不携带抗生素和细菌复制起始位点的迷你超螺旋质粒
不携带抗生素和细菌复制起始位点的迷你超螺旋质粒

不携带抗生素和细菌复制起始位点的迷你超螺旋质粒

MIDGE Vector

2001年,Wittig开发了一种MIDGE质粒系统,它不含有任何非必须的质粒骨架序列,只含有用于基因表达的元件(启动子和编码基因),是一种线性的,末端存通过发卡结构形成一个共价闭合的哑铃形状。用限制性内切酶把表达元件从质粒上切割下来,接着把含有表达元件的双链DNA序列和具有颈环结构的寡核苷酸连接起来,从而形成共价封闭的末端结构,可以避免外切酶的切割。在T7 DNA 聚合酶的作用,剩下的质粒骨架序列被降解。最后,只需一部简单的纯化步骤就可以得到MIDGE质粒。

构建MIDGE载体
构建MIDGE载体

尽管做出了许多改造质粒元件的尝试,但是依然摆脱不了通过细菌发酵的方式获得质粒。mRNA疫苗最耀眼的优势就是快速的研发和生产,而奠定此基础的是mRNA制备过程完全是一个化学合成反应,避开细胞发酵过程。如果生物制剂的整个工艺流程全部靠化学反应合成,不存在黑匣子,以生产可乐的方式生产蛋白/质粒/疫苗,那么既能保证批次的均一性,整个工艺生产也会变得简单可控。但是,当回顾mRNA疫苗生产的整个工艺流程,我们会发现一个漏洞,那就是最上游的模板制备依然是靠生物发酵来完成的。那么我们是否可以找到一种避开生物发酵,纯粹借助高效率高产量的体外合成系统来规模化生产质粒呢?

doggybone DNA 酶法合成体系

为了摒弃数十年的传统质粒生产方式,2010年Touchlight开发出一种新颖的,体外酶法合成DNA载体的方法,称为doggybone DNA或者dbDNA。这套酶法合成系统用到一个非常特殊的原核端粒酶TelN(源自噬菌体N15),具有切割-连接活性,可用于合成线性闭合 mini DNA载体。原核端粒酶TelN识别的靶序列由56个bp回文序列构成,两侧是telRtelL。靶序列中心位置同样是一个回文序列telO。原核端粒酶TelN在telO序列内部切割并且在2个切割末端形成共价闭合的发卡结构,这样产生的mini DNA载体末端依然由telRtelL组成,形似“狗骨头”(doggybone)[7]。

原核端粒酶TelN识别序列telRL
原核端粒酶TelN识别序列telRL

doggybone DNA 体外没法合成系统可以分为两个步骤:

原始质粒由骨架DNA序列和编码靶基因的表达元件组成。靶基因表达元件由CMV启动子,靶基因序列,SV40 polyA 尾巴构成,末端两侧是端粒酶识别序列telRL。首先,利用phi29 DNA聚合酶,以原始质粒DNA为模板进行滚环式复制,产生包含原始质粒序列的串联重复体。接着,加入反应体系的原核端粒酶识别靶基因表达元件两侧的telRL位点,执行切割-连接活性,产生线性的,末端共价连接的mini DNA 单体(靶基因表达元件)。不想要的骨架DNA序列由于具有开口的末端,因此可以通过添加限制性内切酶降解掉。最后纯化去除反应体系的成分和降解的核酸片段,便可以得到只有靶基因表达元件组成的mini DNA。

Touchlight公司开发的酶法合成DNA体系
Touchlight公司开发的酶法合成DNA体系
Doggybone 原核端粒酶识别序列设计
Doggybone 原核端粒酶识别序列设计

doggybone DNA 应用场景

可以这么说,哪里需要用到质粒DNA,哪里就可以用到Doggybone。这种体外的DNA酶法合成系统,完美避开生物发酵过程的诸多不可控风险,能够为现在诸多新兴的技术服务,具有广阔的应用场景。

Doggybone DNA酶法合成体系应用场景
Doggybone DNA酶法合成体系应用场景

DNA 疫苗生产

2014年,John S. Tregoning等人比较分析传统质粒DNA和酶法合成的线性封闭末端DNA用作DNA疫苗时的效果,结果发现,Doggybone和传统质粒上抗原的表达水平基本相当,在小鼠体内能够触发的体液免疫和细胞免疫的水平同传统质粒DNA疫苗达到的也是相当的,并且可以提供有效的抵抗病毒感染的保护效力[8]。这篇文章是第一个通过大规模酶法合成来制备DNA疫苗的,自此之后,许多研究人员开始利用Doggybones来表达抗原。

通过不同方式递送的Doggybones和传统质粒在CHO-K1细胞内的luciferase表达水平
通过不同方式递送的Doggybones和传统质粒在CHO-K1细胞内的luciferase表达水平
通过肌肉注射(电穿孔)把Doggybone和传统质粒注入小鼠体内,luciferase表达水平。通过这组数据,可以发现Doggybone在七天后luciferase变大水平有下降。等摩尔量注射Doggybone和传统质粒时,Doggybone上面luciferase表达水平显然是略低于传统质粒的。
通过肌肉注射(电穿孔)把Doggybone和传统质粒注入小鼠体内,luciferase表达水平。通过这组数据,可以发现Doggybone在七天后luciferase变大水平有下降。等摩尔量注射Doggybone和传统质粒时,Doggybone上面luciferase表达水平显然是略低于传统质粒的。

腺相关病毒AAV生产

腺相关病是最有前景的基因递送载体之一,其最常用的生产方式是通过3个细菌质粒转染HEK239细胞。在这个工艺流程中,包装质粒上面的Rep基因和Cap基因编码产生病毒复制和包装相关的蛋白,辅助质粒提供AAV有效辅助的一系列基因,载体质粒含有靶基因表达元件和末端反向重复序列。

重组腺相关病毒生产工艺中的大规模质粒制备存在许多挑战,例如产能限制,保真度,质粒来源的DNA序列的插入,高成本和长周期的GMP生产工艺。尽管3质粒系统瞬时转染被看作是当面AAV临床和商业化生产的金标,但是,质粒DNA生产过程碰到的许多挑战成为商业规模化生产的瓶颈:在质粒的复制过程,ITR区域经常会发生序列缺失;质粒来源的序列会被包装进AAV;质粒上需要携带抗生素筛选基因;大肠杆菌质粒GMP生产耗时长,成本高。在2017年,K Karbowniczek 等人证实可以通过Doggybone酶法合成体系来进行GMP级别的AAV生产,转染triple-dbDNA到细胞中,能够产生与使用传统质粒相同的病毒滴度。

通过ELISA和qPCR检测Doggybone和传统质粒生产的AAV滴度
通过ELISA和qPCR检测Doggybone和传统质粒生产的AAV滴度

总结

从mRNA疫苗获得的巨大成功可以看出,避开生物发酵,开发体外无细胞合成体系蕴藏的巨大潜力。Touchlight公司开发的Doggybone DNA 是一种新颖的酶法合成DNA技术,可快速实现GMP级别的质粒DNA合成,解决基因治疗领域质粒生产的产能限制。如果能够通过类似Doggybone的体外酶法合成技术来解决mRNA疫苗合成工艺上游的模板制备,那么就会彻底实现mRNA疫苗生产的全化学合成路线,这也应该成为国内mRNA疫苗研发公司创新的一个突破口。

1.Tang DC, DeVit M, Johnston SA. Genetic immunization is a simple method for eliciting an immune response. Nature. 1992; 356:152–4.

2.Luke J, Carnes AE, Hodgson CP, Williams JA. Improved antibiotic-free DNA vaccine vectors utilizing a novel RNA based plasmid selection system. Vaccine. 2009; 27:6454–9.

3.Mairhofer J, Cserjan-Puschmann M, Striedner G, Nöbauer K, Razzazi-Fazeli E, Grabherr R. Marker-free plasmids for gene therapeutic applications—Lack of antibiotic resistance gene substantially improves the manufacturing process. Journal of biotechnology. 2010; 146:130–7

4.van der Heijden I, Gomez-Eerland R, van den Berg JH, Oosterhuis K, Schumacher TN, Haanen JB, et al. Transposon leads to contamination of clinical pDNA vaccine. Vaccine. 2013; 31:3274– 80.

5.Darquet AM, Cameron B, Wils P, Scherman D, Crouzet J. A new DNA vehicle for nonviral gene delivery: supercoiled minicircle. Gene therapy. 1997; 4:1341–9.

6.Form Follows Function: The Design of Minimalistic Immunogenically Defined Gene Expression (MIDGE®) Constructs

7.Heinrich J, Schultz J, Bosse M, Ziegelin G, Lanka E, Moelling K. Linear closed mini DNA generated by the prokaryotic cleaving-joining enzyme TelN is functional in mammalian cells. Journal of molecular medicine. 2002; 80:648–54.

8.Walters, A., Kinnear, E., Shattock, R. et al. Comparative analysis of enzymatically produced novel linear DNA constructs with plasmids for use as DNA vaccines. Gene Ther 21, 645–652 (2014).

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